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培养液对转基因克隆牛胚胎发育的影响

2020-12-11阅读(85)

培养液对转基因克隆牛胚胎发育的影响

论文摘要

体细胞核移植技术（SCNT）给生命科学领域带来了飞跃的发展,也得到了广大科研人员的信赖。但是目前体细胞核移植的效率非常低,尤其是在生产转基因动物方面。影响克隆效率的因素很多,并且都还没有研究透彻。科研人员采用了许多方案来提高克隆效率,但迄今为止,还没有找到能显著提高体细胞克隆牛效率的方法。然而科研人员普遍认为胚胎的体外培养环境,尤其是培养液的组成是胚胎发育的重要因素之一。克隆牛胚胎培养液中普遍都添加了牛血清或牛血清白蛋白。大量研究表明,胚胎过长的暴露于血清中,将显著改变胚胎的形态、改变胚胎的基因表达模式,以及使后代动物易出现肥大综合症（LOS）等。因此,本研究系统比较了mSOF-serum、mSOF-BSA和G1.3/G2.3培养液对转基因克隆牛胚胎发育的影响,比较不同培养液及培养体系对转基因克隆牛胚胎发育的影响。同时为了进一步研究单一因子对转基因克隆牛胚胎发育的影响,设计了一种化学成分确定培养液,检测了胚胎发育率、胚胎细胞凋亡率、抗冻能力等指标,为今后深入研究化学成分确定培养液对转基因克隆牛胚胎发育的影响提供技术依据,为提高转基因克隆效率提供技术支持,为进一步分析胚胎的形态学、分子生物学、生物化学等打下基础。1、利用三种培养液:mSOF-serum、mSOF-BSA和G1.3/G2.3培养转基因克隆牛胚胎。结果发现:三种培养液的卵裂率、D7、D8的囊胚率差异不显著（P>0.05）,但mSOF-serum组胚胎发育速率较快,D6的囊胚率高于其它两组,且与mSOF-BSA差异显著（P<0.05）。mSOF-BSA组D7、D8的囊胚孵化率显著低于其它两组（P<0.05）。G1.3/G2.3组的细胞凋亡数和凋亡率显著低于其它组（P<0.05）。冷冻复苏后mSOF-serum组的存活率显著低于其它组,但mSOF-BSA组24 h、48 h的囊胚孵化率显著低于其它两组（P<0.05）。经RT-qPCR分析发现,G1.3/G2.3组的Oct4和IFNtau表达量显著高于其它组,而mSOF-serum组的Hsp70和Bax表达量显著高于其它组（P<0.05）。因此判定三种培养液均能支持附植前转基因克隆牛胚胎的体外发育,但G1.3/G2.3组的胚胎质量较好,G1.3/G2.3有利于转基因克隆牛胚胎的体外发育。2、三组的胚胎移植后发现,60 d后妊娠维持率差异显著,90 d后G1.3/G2.3组的妊娠维持率高于其它组。120 d后mSOF-serum组流产率高,而G1.3/G2.3组的妊娠维持率高于mSOF-BSA组,但差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,G1.3/G2.3更有利于转基因克隆牛胚胎的体内发育,而mSOF-serum最不利于转基因克隆牛胚胎的体内发育。3、经过优化后的化学成分确定培养液（BCM+PVA+肌醇+EGF+ITS）支持转基因克隆牛胚胎发育的能力与化学成分不确定组（BCM+BSA）相当。两组间的胚胎细胞总数、凋亡率、解冻后的存活率等差异不显著（P>0.05）,但化学成分确定培养液组解冻后48 h的孵化率显著高于化学成分不确定组（P<0.05）。经RT-qPCR分析发现,化学成分确定培养液组的Bax、Igf-2的相对表达量显著低于化学成分不确定组（P<0.05）,Glut-1的相对表达量显著高于化学成分不确定组（P<0.05）。以上表明,优化后的化学成分确定培养液能支持转基因克隆牛胚胎发育,且获得的胚胎质量较好。4、运用亚硫酸氢盐法检测化学成分确定和化学成分不确定培养组胚胎Igf-2的甲基化模式,结果发现化学成分确定培养液组的Igf-2甲基化程度显著高于化学成分不确定组（P<0.05）,但与IVF甲基化水平相当。由此表明化学成分确定培养液更有利于转基因克隆牛胚胎的重编程。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 转基因克隆动物研究概述
  • 1.1 体细胞核移植研究进展
  • 1.1.1 国内外核移植技术研究现状
  • 1.1.2 体细胞核移植与细胞重编程
  • 1.2 转基因克隆研究进展
  • 1.2.1 国外转基因研究进展
  • 1.2.2 国内转基因研究进展
  • 1.3 动物转基因技术
  • 1.3.1 原核注射法
  • 1.3.2 精子载体介导法
  • 1.3.3 胚胎干细胞介导法
  • 1.3.4 病毒载体法
  • 1.3.5 体细胞核移植法
  • 1.4 转基因的应用现状与存在的问题
  • 1.4.1 转基因的应用现状
  • 1.4.2 转基因动物面临的问题
  • 1.5 前景与展望
  • 第二章 哺乳动物胚胎体外培养体系（IVC）的研究概况
  • 2.1 哺乳动物胚胎培养体系研究概述
  • 2.2 胚胎培养类型及培养体系
  • 2.2.1 单一培养体系
  • 2.2.2 序贯培养体系
  • 2.2.3 共培养体系
  • 2.3 哺乳动物胚胎的发育机理及发育动力学
  • 2.3.1 胚胎的发育机理
  • 2.3.2 附植前胚胎发育动力学
  • 2.4 培养液中的主要物质及对胚胎发育的影响
  • 2.4.1 葡萄糖对胚胎发育的影响
  • 2.4.2 氨基酸对胚胎发育的影响
  • 2.4.3 铵
  • 2.4.4 EDTA
  • 2.4.5 大分子物质
  • 2.4.6 生长因子
  • 2.5 前景与展望
  • 第三章 培养液对转基因克隆牛胚胎发育的影响
  • 3.1 试剂和材料
  • 3.1.1 试剂与仪器
  • 3.1.2 材料
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 供体细胞的准备
  • 3.2.2 转基因体细胞克隆胚胎的构建及体外培养
  • 3.2.3 囊胚的细胞计数和凋亡染色
  • 3.2.4 囊胚的冷冻与复苏
  • 3.2.5 发育重要基因m RNA相对表达水平检测
  • 3.2.6 胚胎移植
  • 3.2.7 试验设计
  • 3.2.8 数据统计与分析
  • 3.3 实验结果
  • 3.3.1 hLYZ的细胞转染
  • 3.3.2 转基因阳性囊胚的检测
  • 3.3.3 不同培养液对转基因克隆胚体外发育的影响
  • 3.3.4 不同培养液对转基因克隆囊胚细胞数和细胞凋亡的影响
  • 3.3.5 不同培养液对转基因克隆囊胚的冷冻与复苏的影响
  • 3.3.6 不同培养液对转基因克隆囊胚发育重要基因的表达水平的影响
  • 3.3.7 不同培养液对转基因胚胎体内发育的影响
  • 3.4 讨论
  • 3.5 小结
  • 第四章 化学成分确定培养液对转基因克隆牛胚胎的研究
  • 4.1 试剂和仪器
  • 4.1.1 试剂与材料
  • 4.1.2 仪器
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 供体细胞的准备
  • 4.2.2 转基因体细胞克隆胚胎的构建及培养
  • 4.2.3 囊胚的细胞计数和凋亡染色
  • 4.2.4 囊胚的冷冻与复苏
  • 4.2.5 发育重要基因m RNA相对表达水平的检测
  • 4.2.6 印记基因Igf-2甲基化模式的检测
  • 4.2.7 试验设计
  • 4.2.8 数据统计与分析
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 BSA、PVA和肌醇对转基因克隆胚胎发育的影响
  • 4.3.2 DC-medium中EGF和ITS对转基因克隆胚胎发育的影响
  • 4.3.3 DC-medium对转基因克隆囊胚细胞数和凋亡的影响
  • 4.3.4 DC-medium对转基因克隆囊胚冷冻与复苏的影响
  • 4.3.5 DC-medium对转基因克隆囊胚重要基因的表达水平的影响
  • 4.3.6 DC-medium对转基因克隆囊胚Igf-2甲基化模式的影响
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简介

    • 相关论文文献

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