呼肠孤病毒3型S1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

呼肠孤病毒3型（reovirus type 3,Reo-3）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）、双链RNA病毒[1]。呼肠孤病毒3型是实验动物SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必须检测项目[2]。其自然感染宿主比较广泛[3],如人类、小鼠、大鼠、猴、牛等,可隐性感染动物并在体内产生抗体,给血液制品、单克隆抗体、细胞培养等外来致病因子的检定及动物试验带来一定的困难[4]。因此建立快速诊断方法十分必要。目前,检测呼肠孤病毒3型主要用酶联免疫吸附法（ELISA）检测,其抗原获得方法主要为细胞培养,但很难获得高滴度的病毒;病毒虽可在鸡胚内增殖,但没有规律性[5]。本研究利用大肠杆菌表达系统pQE31表达呼肠孤病毒δ1蛋白抗原部分,用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,可用于呼肠孤病毒血清抗体的检测。用生物学软件DNAstar分析δ1蛋白,根据GenBank中报道的Reo-3 S1基因序列（gi:61780）设计特异性引物,用一步法RT-PCR方法扩增S1基因的主要抗原片段SR,将其插入到pMD18-T载体中,酶切鉴定后测序。将阳性重组质粒用Sph I+Sal I双酶切后连接到同样双酶切的表达载体pQE-31上,转化E.coli M15（pREP-4）,IPTG诱导表达。对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot的结果表明,SR基因在E.coli M15中获得表达,表达蛋白SR-δ1分子质量约为32 kD,与预期大小相符,能与Reo-3阳性血清发生特异性反应,说明SR-δ1有很高的抗原性。把表达的SR-δ1重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原,建立了检测Reo-3血清抗体的间接ELISA方法,并确定了最适抗原包被浓度（0.6μg/mL）、最适血清稀释度（1:100）、血清最适作用时间（150 min）、最适封闭液（8%脱脂奶粉）、最适封闭时间（45min）、酶标抗体最适稀释度（1:8000）、酶标二抗最适作用时间（60min）、底物最适显色时间（10 min）和判定界值（0.292）。包被的重组抗原不与EcT（鼠痘病毒）、SeV（仙台病毒）、MHV（小鼠肝炎病毒）、PVM（小鼠肺炎病毒）阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,说明该方法具有很好的重复性。该诊断方法与国家实验动物检测中心建立的ELISA检测试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为98.5%、100%和98.7%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆了Reo-3 S1基因,进行了表达。利用表达的SR-δ1蛋白成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为实验动物的质量控制、开发商品化试剂盒提供了技术支持。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
• 第一部分：呼肠孤病毒3 型51 基因的克隆、表达及免疫学初步研究
• 1. 材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二部分：呼肠孤病毒3 型抗体的间接ELISA 检测方法的建立及应用
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文