特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定

论文摘要

利用基因工程操作技术克隆了4个分别含有表达产物为147个氨基酸的酵母转录激活因子核苷酸序列和（或）核定位信号（NLS）和（或）Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）穿膜肽（Tat）的嵌合核苷酸序列,并分别命名为GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a（+）,分别构建了原核表达质粒pET28-G（含GAL4/147序列）、pET28-NG（含NLS-GAL4/147序列）、pET28-TG（含Tat-GAL4/147序列）和pET28-TNG（含Tat-NLS-GAL4/147序列）。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,并对诱导时间、培养温度、培养转速、IPTG浓度等表达条件进行优化,从获得目的蛋白G （pET28-G表达产物）、NG （pET28-NG表达产物）、TG （pET28-TG表达产物）和]NG （pET28-TNG表达产物）。结合本课题组构建的含有能够被GAL4识别和结合的半乳糖上游激活序列（UAS）、绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达质粒（pUAS-EGFP）,对所表达蛋白在细胞内和细胞外水平的UAS序列特异性结合和转导功能进行了探讨。结果表明,G、NG、TG和TNG均可有效的识别和结合含有UAS序列的质粒DNA；含有Tat片段的TG和TNG能够有效的将携带UAS序列的pUAS-EGFP质粒转导入真核细胞,且实现所转导pUAS-EGFP质粒外源基因（EGFP）的表达。结合本课题组构建的含有UAS序列、凋亡素基因（Apoptin）的真核表达质粒pUAS-Apoptin和所制备的多结构域嵌合蛋白,在体内、外分别对肝癌细胞HepG-2和C57BL/6小鼠荷肝癌模型进行了抑瘤作用研究。MTT检测、AO/EB检测、DAPI检测、Caspase酶检测、线粒体膜电位检测、细胞活性氧水平检测等细胞水平检测结果和免疫指标、抑瘤率、平均生存期、肿瘤生长趋势等模型动物体内检测结果表明,多结构域嵌合蛋白可以有效的介导pUAS-Apoptin对人肝癌细胞HepG-2和模型动物体内实体肿瘤的抑制。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第1篇 绪论
• 第2篇 文献综述
• 第1章 基因治疗研究进展
• 1.1 概述
• 1.2 基因治疗的伦理学
• 1.3 严谨的遗传序列变化
• 1.4 体细胞基因治疗
• 1.5 转基因传递方法
• 1.6 内源性基因表达的抑制
• 1.7 体基因疗法:特殊途径
• 1.8 体基因疗法的伦理学
• 1.9 种系基因治疗
• 1.10 种系基因治疗的应用
• 1.11 种系基因治疗的伦理学
• 1.12 肿瘤基因治疗策略
• 第2章 基因治疗载体研究进展
• 2.1 概述
• 2.2 病毒载体
• 2.3 非病毒载体
• 2.4 结语
• 第3篇 研究内容
• 第1章 原核表达质粒的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 多结构域嵌合蛋白在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 多结构域嵌合蛋白的体外转导作用研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第4章 多结构域嵌合蛋白的体内转导作用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第4篇 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢