棉花GhWRKY15基因的分离及其功能研究

论文摘要

植物定植在一定的生长环境中，虽然缺乏一套循环性的和肉体的适应性免疫系统，但是它们在长期的进化中形成了一套特殊的天然免疫系统。植物通过这种特殊的天然免疫系统，调控一部分具有调节作用的基因的表达，进而控制靶基因的表达，以保护植物免受各种病原和非病原侵害；或直接通过改变这些调节基因表达以应对各种不良环境因素。因此，众多调节基因及其靶基因构成了复杂的信号转导系统，赋予植物防御各种不良环境因素侵害的能力。有研究表明，在这种复杂信号转导系统中，大多数抗性相关基因的激活需要特异转录因子的表达或它们的DNA结合活性的改变。WRKY家族是近年来研究较为广泛的一类重要转录因子，它在植物应对各种各样的生物或非生物胁迫和植物生长、发育、衰老等进程中具有重要的作用。虽然以往的研究揭示了WRKY转录因子的各种功能，但是WRKY转录因子的作用机制并不清楚，有待进一步的探究。此外，目前关于WRKY转录因子的研究主要集中在拟南芥和水稻中，而对重要的经济作物棉花中WRKY成员的研究非常少，了解棉花中相关抗逆基因包括WRKY转录因子的功能具有重要的理论意义和应用价值。本研究以鲁棉22为实验材料，首次从棉花中克隆得到一个IId亚族的WRKY基因，通过序列比对、亚细胞定位分析、基因表达特性分析和过表达植株抗性分析等方法初步探究了该棉花WRKY基因的功能，主要的研究结果如下：（1）本研究利用同源克隆的方法，从棉花中分离得到一个WRKY基因，命名为GhWRKY15。序列分析表明，其cDNA全长为1101bp，编码一个含314个氨基酸的多肽，预测的蛋白质分子量为32.463kDa。DNA结构分析表明，该基因具有两个内含子，表现为一个拷贝。预测的GhWRKY15与其它同源蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性，如与NtWRKY3（BAA77358）、AtWRKY15（NP179913）、StWRKY2（ABU49721）和PtWRKY16（ACV92028）的相似性分别为42.60%、49.70%、54.27%和63.19%。此外，亚细胞定位结果表明，GhWRKY15蛋白特异性的定位于细胞核中。（2）利用反向PCR的方法克隆得到GhWRKY15的部分启动子序列，大小为1012bp，利用PlantCARE软件，预测得到一系列与应答环境胁迫和植物生长发育相关的顺式作用元件。因此，GhWRKY15可能参与到与这些元件相关的功能应答中。（3）构建GhWRKY15的正义表达载体pBI121-GhWRKY15，利用农杆菌侵染的方法转化烟草，得到GhWRKY15基因的过表达烟草植株。该转基因烟草植株较野生型植株表现出对病毒和真菌的抗性。在接种病原菌后，转基因植株中的几种病原相关基因、NPR1基因和ET合成途径中的两个关键酶基因ACO和ACS的表达量较野生型植株均有所升高。利用氧化剂甲基紫晶处理烟草幼苗，转基因烟草的抗氧化酶POD和APX的酶活性较野生型升高；qRT-PCR结果表明，NtAPX1和NtGPX基因的表达也有所增强。此外，Northern blot分析发现，棉花幼苗中的GhWRKY15的表达受到真菌与SA、MeJA和MV的诱导。（4）GhWRKY15的表达量水平在野生型棉花幼苗的根部和茎部较在叶部高，并且转基因植株的茎部拔节较野生型早。（5）此外，棉花幼苗中的GhWRKY15的表达受到非生物胁迫包括冷、伤和干旱，和与生长发育相关的GA3和ABA信号分子的诱导。综上所述，GhWRKY15在植物抗真菌和病毒胁迫中起着重要的作用，可能是作为ROS系统的一个调节因子参与各种抗病信号途径。GhWRKY15也可能调节烟草植株的生长和发育，特别是茎的生长。这些研究结果暗示着WRKY蛋白介导的抗病途径和生长发育进程可能有些内在的联系。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物先天免疫系统
• 1.2 转录因子
• 1.3 WRKY 转录因子
• 1.3.1 WRKY 转录因子发现
• 1.3.2 WRKY 转录因子结构特点
• 1.3.3 WRKY 转录因子的分类
• 1.3.4 WRKY 基因的起源与分子进化
• 1.3.5 WRKY 转录因子结合的 DNA 序列
• 1.3.6 WRKY 转录因子的生物学功能
• 1.3.6.1 WRKY 转录因子在植物防卫反应中的作用
• 1.3.6.2 WRKY 转录因子在植物生长发育中的调节作用
• 1.3.6.3 WRKY 转录因子在植物物质代谢中的调控作用
• 1.4 本实验的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 棉花的培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶与各种生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物总 RNA 的提取
• 2.2.2 RNA 中基因组 DNA 的去除
• 2.2.3 甲醛变性凝胶进行 RNA 电泳
• 2.2.4 cDNA 第一链的合成
• 2.2.5 cDNA 纯化和加尾反应（用于 5 RACE）
• 2.2.5.1 cDNA 的纯化
• 2.2.5.2 cDNA 5′末端加尾反应
• 2.2.6 植物基因组 DNA 的提取
• 2.2.7 电泳目的片段的回收
• 2.2.8 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.10 大肠杆菌微量质粒 DNA 提取和质粒酶切鉴定
• 2.2.10.1 试剂盒微量提取大肠杆菌质粒 DNA
• 2.2.10.2 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.11 DNA 序列测定
• 2.2.12 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.13 GhWRKY15 全长基因组序列的获得
• 2.2.14 Northern 杂交
• 2.2.15 基因枪基因瞬时表达
• 2.2.16 植物表达载体的构建、转化及转化植株鉴定
• 2.2.16.1 植物表达载体的构建
• 2.2.16.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.16.3 农杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.16.4 农杆菌的培养
• 2.2.16.5 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.16.6 转基因烟草的鉴定
• 2.2.17 转基因植株的抗病分析
• 2.2.18 网络资源及数据库
• 2.2.19 生物学软件
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花 GhWRKY15 基因的分离
• 3.1.1 棉花 RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 GhWRKY15 中间片段的分离
• 3.1.3 GhWRKY15 的 5′片段的分离
• 3.1.4 GhWRKY15 的 3′片段的分离
• 3.1.5 GhWRKY15 全长 cDNA 的分离
• 3.2 GhWRKY15 的序列分析
• 3.2.1 GhWRKY15 的全长 cDNA 序列分析
• 3.2.2 GhWRKY15 蛋白序列分析
• 3.2.3 GhWRKY15 基因组序列分析
• 3.2.4 GhWRKY15 基因拷贝数分析
• 3.2.5 GhWRKY15 启动子序列的分离与序列分析
• 3.3 GhWRKY15 的亚细胞定位分析
• 3.4 GhWRKY15 基因的的表达特性分析
• 3.5 GhWRKY15 过表达烟草植株的获得和鉴定
• 3.5.1 植物表达载体的构建
• 3.5.2 再生植株的获得
• 3.5.3 转基因植株的鉴定
• 3.6 GhWRKY15 过表达植株的抗病分析
• 3.6.1 病毒抗性分析
• 3.6.2 真菌抗性分析
• 3.7 抗性相关基因和乙烯合成相关基因的表达模式
• 3.8 过表达转基因植株的抗氧化分析
• 3.8.1 ROS 的测定和 MV 处理下 GhWRKY15 基因的表达模式
• 3.8.2 抗氧化基因的表达模式
• 3.8.3 抗氧化酶活性测定
• 3.9 GhWRKY15 过表达烟草的生长和发育
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间专利申请和发表论文情况