ebv-miR-BHRF1-1通过抑制p53调节鼻咽癌细胞中EBV感染状态的分子机制研究

论文摘要

miRNA（microRNA）是近年来发现的一类长约22nt的非编码小RNA分子。在胞浆内与特定蛋白形成微核酸蛋白复合体（miRNPs,micro-ribonucleouproteins）,通过对靶基因mRNA的序列特异性裂解、抑制翻译的起始或延长、降解多聚腺苷酸尾或者介导肽链水解等机制在翻译水平抑制其靶基因的表达。但是,人们对miRNA在形成蛋白复合体并靶向调节基因的过程中的具体机制,仍然知之甚少。miRNAs广泛存在于从病毒到高等多细胞生物,目前采用生物信息学预测,在低等多细胞动物和植物中存在一两百条miRNAs,而在人类可能存在至少一千条。对miRNAs功能的研究提示几乎参与所有细胞内进程的调节,在包括肿瘤在内的人类所有病理过程中都能观察到其表达的异常。这一发现与生物信息学所预测的,哺乳动物中约30%蛋白编码基因受到miRNAs的调节相一致。病毒在感染宿主细胞后,需要调节自身和宿主两方面的基因表达,使其自身存在得以维持和复制,潜伏感染以维持自身存在,部分进入复制周期以使自身繁殖扩增,两者之间的平衡,避免了自身过多复制引起宿主细胞的死亡。这种平衡对病毒来说很重要。多数病毒也能编码miRNAs并广泛参与病毒与宿主的相互作用。EB病毒是人类疱疹病毒,与包括鼻咽癌在内的多种人类疾病密切相关。该病毒目前发现编码至少32条miRNAs,据其在基因组中的位置分为两组:BHRF1组和BART组。其中BHRF1组位于病毒复制早期基因BHRF1内,BART组则位于病毒潜伏期转录产物BART内。BART组miRNA已证实可以抑制病毒复制,维持其较低的复制水平。BHRF1组在病毒裂解复制水平增高时表达增加,提示其与病毒裂解复制的调控相关。但是,生物信息学分析并没有发现BHRF1组miRNA在病毒裂解复制期基因中存在作用位点,只有ebv-miR-BHRF1-1在人p53mRNA 3’-非编码区（3’-UTR,3’-Untranslated regions）存在两个作用靶位点。P53是重要的抑癌基因,在多种肿瘤中存在突变。但是,在鼻咽癌中p53基因的突变频率很低（＜10%）,并出现了p53蛋白积聚现象。作为调节细胞周期进程和细胞凋亡的重要基因,多数病毒在宿主细胞内进行自身复制时,需要通过不同的途径来抑制p53的功能,来使宿主细胞内环境处于类S期,并抑制细胞的凋亡,为病毒自身复制提供原料和赢得时间。而且研究发现,EB病毒裂解复制立刻早期基因蛋白Zta,作为病毒裂解复制的开关基因,在病毒进入裂解复制周期时可以和p53结合,抑制其转录激活功能。说明EB病毒在复制过程中同样需要抑制p53的功能以为其自身复制提供有利条件。那么野生型p53蛋白在鼻咽癌中的积聚,可能在鼻咽癌中EB病毒低水平复制的维持中具有重要意义。由此,我们推测:EBV编码的ebv-miR-BHRF1-1可能通过调节宿主细胞相关基因p53的表达,进而调节p53与Zta相互作用而参与调节EBV潜伏与裂解两种状态的转换。我们采用TPA诱导SUNE1内病毒裂解复制水平增高后,采用RT-PCR方法证实在病毒裂解复制水平增高后,ebv-miR-BHRF1-1的表达也随之上调,而p53蛋白水平和下游基因mdm2水平随之下调,同时细胞周期检测证实S期细胞增加而凋亡细胞减少,ebv-miR-BHRF1-1的上调与p53的下调及功能受抑有利于病毒复制,且两者之间存在联系。然后,我们采用反义RNA特异性抑制ebv-miR-BRHRF1-1之后,再以TPA处理SUNE1,发现病毒裂解复制早期蛋白Zta和Ea-D上调幅度减小,说明裂解复制水平提高的幅度减小,而p53蛋白水平和mdm2水平的下调也减弱,mdm2水平甚至得到逆转,说明p53功能的受抑制程度也得到了逆转。接下来,我们构建ebv-miR-BHRF1-1的过表达载体,转染SUNE1细胞,观察GFP蛋白表达证实转染效率,以RT-PCR检测证实成熟ebv-miR-BHRF1-1得到表达,再检测病毒复制早期蛋白Zta和Ea-D水平以及p53蛋白和mdm2蛋白水平,比较对病毒复制水平的影响和对p53的抑制作用。发现在过表达ebv-miR-BHRF1-1后,病毒裂解复制水平提高而p53蛋白水平和功能受到了抑制。以上研究结果表明,EB病毒编码的miR-BHRF1-1通过调节宿主细胞相关基因p53的表达参与病毒裂解复制的调节,初步阐明EBV编码的miR-BHRF1-1参与调节EBV两种感染状态的平衡以及维持EBV的持续存在中的作用机制。为EBV相关肿瘤的发生机制提供新的理论依据,并为以EBV编码的miRNAs为切入点治疗EBV相关肿瘤的实验研究提供新的理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写注解
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 细胞系
• 2.2 引物
• 2.3 培养液及血清
• 2.4 主要试剂
• 2.5 主要仪器
• 2.6 主要抗体
• 2.7 质粒
• 3 主要方法
• 3.1 细胞全蛋白的提取和浓度测定
• 3.2 Western-blottting方法和二次发光检测
• 3.3 细胞总RNA的抽提和浓度测定
• 3.4 逆转录PCR（RT-PCR）
• 3.5 基因组DNA抽提和浓度测定
• 3.6 real-time PCR检测EB病毒拷贝数
• 3.7 流式细胞周期检测
• 3.8 感受态细菌的转化
• 3.9 细菌培养和质粒抽提
• 3.10 Lipofectamine TM 2000 transfection reagent介导的瞬间转染
• 4 结果
• 4.1 TPA诱导可以促进B95-8细胞内EBV裂解复制水平明显上调
• 4.2 在以TPA处理后,EB病毒阳性鼻咽癌细胞内病毒裂解复制水平提高
• 4.3 在EBV阳性鼻咽癌细胞SUNE1内EBV发生裂解复制以后,ebv-miR-BHRF1-1的水平上调
• 4.4 TPA诱导鼻咽癌细胞内EBV发生裂解复制后,p53表达和功能受到了抑制
• 4.5 特异性抑制ebv-miR-BHRF1-1以后,TPA对鼻咽癌细胞内EBV裂解复制的诱导和抑制p53表达和功能的作用受到抑制
• 4.6 过表达miR-BHRF1-1以后,鼻咽癌细胞内p53蛋白和mdm2的表达受到了抑制,而EBV裂解复制水平提高
• 5 分析与讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间的主要研究成果