亚欧型与南非型口蹄疫病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,主要侵害偶蹄兽,偶见于人和其他动物。由于FMDV是单股RNA病毒,有很高的变异能力,其抗原性的变异非常频繁,故给口蹄疫的防制带来了很大的困难。快速准确地诊断FMD对于及时控制扑灭疫情极其重要,因此,FMDV快速检测方法一直都是各国学者研究的热点问题。口蹄疫分为7个血清型（O、A、C、亚洲Ⅰ型、南非1、2、3型）,鉴于目前我国发生的口蹄疫疫情主要是由亚欧型（A、O及Asia-Ⅰ型等）口蹄疫病毒引起的,本试验从Genebank中获得7种血清型FMDV RNA基因组序列,应用MegALign软件分析其序列,根据Taqman探针设计原则,利用软件Beacon designer 7.0在5’端非翻译区保守区设计亚欧型（Prime:L6/U6;Probe:P6）与南非型(Prime:AY48U/AY48L;Probe:AY48P特异的引物与探针,建立了快速检测亚欧型与南非型FMDV的多重实时荧光PCR方法,同时将目的片段插入T载体,构建重组质粒,为所建立的多重荧光PCR方法提供阳性物质,特异性试验显示,2套引物／探针可以有效区分亚欧型与南非型代表株,敏感性试验结果显示,在多重荧光PCR体系下,检测亚欧型及南非型阳性质粒的灵敏度可达20个拷贝。同时用梯度稀释的质粒制作标准曲线,线性范围较宽（2.0×107-2.0×10拷贝）,亚欧型质粒标准曲线的扩增效率92.9%,相关系数为0.991,标准方程为y=-3.506x+41.697；南非型质粒标准曲线的扩增效率91.8%,相关系数为0.992,标准方程为y=-3.535x+42.935,曲线斜率和扩增效率均可满足定量要求。为了更快速、简便的检测亚欧型与南非型FMDV,建立了一步法多重Real Time RT-PCR方法。为获得荧光RT-PCR检测方法的阳性模板,在上游引物U6、AY48L的5’端导入T7启动子序列,PCR扩增后得到带有T7启动子序列的产物片段,利用Promega公司体外转录试剂盒合成cRNA,对生成的cRNA进行质控试验,确定无质粒DNA残留；同时对Script Reverse Transcriptase酶、引物／探针浓度与退火温度等进行了优化,确定了反应体系与反应条件,对倍比稀释的cRNA进行敏感性检测,南非型FMDV最低可检测至7.6×10-9ng／μL,亚欧型FMDV最低可检测值为6.3×10-8ng/μL。对直接提取的7种血清型FMDV的RNA进行特异性试验,结果显示本方法可以有效区分亚欧型与南非型FMDV的核酸,本研究为亚欧型与南非型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法,也为亚欧型与南非型FMDV检测试剂盒的研制提供了有效的技术支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1 口蹄疫
• 1.1 口蹄疫概述
• 1.2 口蹄疫病毒结构及基因组组成
• 1.3 2008年以来世界口蹄疫流行动态
• 1.4 口蹄疫的诊断
• 2 TaqMan实时荧光PCR方法概述
• 2.1 TaqMan技术的工作原理
• 2.2 TaqMan技术的应用现状和前景
• 3 本论文研究目的及意义
• 试验部分
• 第一章 亚欧型/南非型FMDV阳性模板基因的克隆及多重荧光PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 一步法RT-PCR扩增产物电泳结果
• 2.2 质粒PCR鉴定结果
• 2.3 重组质粒测序与PCR鉴定结果
• 2.4 亚欧型FMDV阳性模板反应体系的优化结果
• 2.5 南非型FMDV阳性模板反应体系的优化结果
• 2.6 多重real-time PCR反应体系与反应条件的确立
• 2.7 多重real-time PCR的标准曲线及敏感性检测结果
• 2.8 多重real-time PCR的特异性试验结果
• 2.9 重复性及稳定性试验结果
• 3 讨论
• 第二章 亚欧型/南非型FMDV多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 扩增带T7启动子序列的重组质粒试验结果
• 2.2 体外转录cRNA结果
• 2.3 多重real-time RT-PCR检测方法反应体系的优化结果
• 2.4 多重real-time RT-PCR检测方法的建立
• 2.5 敏感性试验结果
• 2.6 特异性试验结果
• 2.7 重复性与稳定性试验结果
• 2.8 样品检测结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢