结直肠癌中Hedgehog信号通路的配体依赖性活性改变及其表观修饰机制研究

论文摘要

背景与目的目前已经知道,Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎的正常发育中起着非常重要的作用。近年来的研究发现,Hh信号通路可能在成体组织中再度激活,从而在肿瘤发生中起重要作用。Hh有三种同分子体配体:Sonic hedgehog（SHH）,Indian hedgehog（IHH）和Desert hedgehog（DHH）,其中对SHH的研究最多,主要是因为传统观点认为:SHH在各种组织中均有表达,SHH的实验结果通常适用于Hh的其它同分子体（IHH、DHH）。但是,最近的研究结果对Hh三种同分子体的功能重叠性提出了质疑,有研究表明,在肿瘤形成过程中,IHH并不是SHH的功能同系物。SHH和IHH在胃肠道早期发育的几个关键过程中是必需的,结肠中主要表达这两种形式的配体。Hh配体结合跨膜受体Patched（PTCH）后,释放PTCH介导抑制的Smoothened（SMO）受体。SMO阻遏解除使GLI锌指转录因子激活并转入核内,促进Hh靶基因的转录。脊椎动物有3种GLI,即GLI-1、GLI-2和GLI-3,是Hh信号通路的最终效应分子,其中GLI-1激活大部分Hh信号通路靶基因的转录,其本身也是Hh信号通路的靶基因。肿瘤中Hh信号通路的异常激活主要是通过基因突变（配体非依赖性）或配体高表达（配体依赖性）实现的。文献报道,PTCH、SMO、Suppressor of Fused（SUFU）基因突变与基底细胞癌、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤中Hh信号通路的激活有关。另一方面,在一些消化道肿瘤中发现了该通路的配体依赖性激活,包括:肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、胆管癌。此外,消化道肿瘤中很少发现Hh通路组成成分的突变,提示消化道肿瘤中Hh信号通路的激活是配体依赖性的。有关Hh信号通路在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）中的确切作用,目前已作了大量研究。但是,有关该通路在CRC中是否激活的研究结果互相矛盾,Hh通路阻滞剂对结肠癌细胞活性的影响也存在争议。此外,Hh信号通路在结直肠肿瘤发生中的调节机制尚未完全阐明。因此,阐明Hh信号通路在结直肠癌中的作用及其调节机制,可望为其治疗措施带来新的发现。表观遗传修饰是基因表达调控的最重要机制之一,尤其是DNA甲基化在肿瘤发病机制的表观修饰异常中研究得最为广泛。DNA甲基化检测方法众多,选择合适的方法对于甲基化研究至关重要,但目前国内尚缺乏对常用甲基化检测方法的系统评价。本研究目的在于研究结直肠肿瘤中Hh信号通路的配体依赖性活性,并试图阐明结直肠肿瘤发生过程中Hh配体表达的调控方式。另外,本研究对常用甲基化检测方法进行初步评价,为甲基化研究提供参考。材料和方法一、Hh信号通路在原发性结直肠肿瘤中的活性研究。1、收集21例结直肠腺瘤（adenoma,AD）和18例CRC标本。每例标本分为两部分:一部分立即液氮冷冻,-80℃保存备用;另一部分10%福尔马林固定,石蜡包埋。2、采用半定量RT-PCR方法,检测结直肠肿瘤组织中Hh信号通路关键分子SHH、IHH、GLH mRNA的表达水平。3、采用免疫组织化学方法,检测结直肠肿瘤组织中SHH、IHH、GLI1蛋白质的表达,并采用半定量方法对组织化学染色进行评分。二、Hh信号通路在结肠癌细胞株中的活性研究。采用半定量RT-PCR方法,检测HCT8、SW1116、SW480和Lovo 4株结肠癌细胞株中Hedgehog信号通路关键分子SHH、IHH、PTCH、SMO、GLH mRNA的表达水平。三、Hh信号通路在CRC中配体依赖性活性调控机制的研究。1、去甲基化试验在4株结肠癌细胞株中进行去甲基化试验,10μM 5-氮-2-脱氧胞苷（5-aza-dCyd）去甲基化处理4株结肠癌细胞株5天,对照组仅给予PBS处理,同样条件下培养。每个细胞株均进行3次重复独立试验。观察去甲基化处理对4株结肠癌细胞株SHH、IHH、PTCH、SMO、GLI1 mRNA表达的影响,筛选可能被高甲基化沉默的基因。2、亚硫酸氢盐修饰后测序法（bisulfite sequencing,BSP）采用BSP方法,检测细胞株中SHH、IHH基因启动子的甲基化状态。从细胞株及组织中提取基因组DNA,取2μg进行亚硫酸氢盐修饰后,半巢式PCR扩增,将扩增产物亚克隆入pGMT-T载体。然后对克隆进行测序分析,细胞株中至少检测5个克隆,组织至少检测10个克隆。3、甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）采用MSP方法,检测原发性肿瘤组织中SHH、IHH基因的甲基化状态。亚硫酸氢盐修饰后的DNA作为MSP的模板,采用对甲基化或非甲基化序列特异的引物进行扩增。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上分离,EB染色,紫外灯下成像观察。四、甲基化检测方法的初步评价。1、以含SHH全甲基化克隆序列和全非甲基化克隆序列质粒为模板,对常用甲基化检测方法,包括BSP、MSP、combined bisulfite restriction analysis（COBRA）、PCR产物直接测序进行初步评价。2、BSP:TA克隆试剂盒将BSP扩增产物亚克隆进pGMT-T载体,采用下游引物测序分析。3、MSP:以含不同比例甲基化序列的质粒混合物作为模板,检测MSP方法对甲基化序列检出的敏感性。4、COBRA:对含不同比例甲基化序列的模板进行PCR扩增,随后采用限制性内切酶HhaⅠ对PCR产物进行酶切消化。5、传统亚硫酸氢盐修饰后直接测序法:采用BSP引物扩增不同比例甲基化序列模板,随后采用下游引物对PCR产物进行直接测序分析。6、标记引物亚硫酸氢盐修饰测序法:采用标记引物扩增不同比例甲基化序列模板,随后采用下游tagged引物对产物进行直接测序分析。五、统计学处理计量资料以（?）±SD表示,计数资料以百分比（%）表示。采用SPSS13.0对数据进行分析,连续变量两组间比较采用独立t检验或Mann-Whitney U检验。分类变量两组间比较采用x2检验或Fisher精确概率法,P＜0.05认为差异有统计学显著性,所有检验均为双侧。结果1.原发性CRC中存在Hh信号通路的SHH配体依赖性激活。SHH mRNA在CRC组和AD组中无显著差异（t＝-0.225,P＝0.823）;与AD组相比,CRC组IHH mRNA水平（Mann-Whitney U检验,Z＝-3.197,P＝0.001）及GLI1 mRNA水平（t＝2.787,P＝0.008）均显著降低。但是,SHH蛋白（Mann-Whitney U检验,Z＝-4.407,P＜0.001）和GLI1蛋白（t＝-2.213,P＝0.033）在CRC组的表达显著高于AD组;IHH蛋白在CRC及AD组中均为阴性或弱阳性表达,两组间无显著差异（t＝0.696,P＝0.491）,而在腺瘤旁正常组织常常有IHH的阳性表达。2.结肠癌细胞株中Hh配体转录物表达缺失,去甲基化处理能诱导其重新表达。除了SHH mRNA在HCT8有表达外,SHH、IHH mRNA在大部分结肠癌细胞株中均没有表达,大部分Hh通路组成成分在低分化的Lovo细胞中均没有表达。5-氮-2-脱氧胞苷去甲基化处理细胞5天后,能诱导SHH和IHH mRNA在HCT8、SW1116和SW480的重新表达,但在Lovo细胞中没有表达。此外,去甲基化处理后,没有观察到PTCH和SMO mRNA表达的显著增加。3.结肠癌细胞株中SHH和IHH基因启动子高甲基化。我们在Lovo细胞株中未能扩增出BSP产物。HCT8、SW1116和SW480结肠癌细胞株中,SHH基因5’端CpG岛为高甲基化,IHH基因5’端CpG岛部分甲基化。4.原发性CRC中SHH基因的低甲基化以及IHH基因的高甲基化。50.0%的AD和70.6%的CRC中检出IHH甲基化;80.0%的AD中检出SHH高甲基化,而SHH在CRC中的甲基化率仅为23.5%,显著低于AD组（P＝0.001）。5.常用甲基化检测方法中,每种方法各有其优缺点。（1）BSP法能精确分析目的序列中每个CpG位点的甲基化状况;（2）MSP检测甲基化具有高灵敏度的优点,提高MSP退火温度能克服假阳性结果的产生;（3）COBRA容易出现非甲基化偏性;（4）PCR产物直接测序定量分析存在信号质量差、C峰过度代偿的问题。结论1.SHH配体依赖性Hh信号通路激活可能在原发性CRC发生中起重要作用。2.IHH表达缺失或下调可能是结直肠肿瘤进展过程中的一个早期事件。3.结肠癌细胞株中不存在Hh信号通路的配体依赖性活性。4.SHH、IHH在原发性结直肠肿瘤和结肠癌细胞株中的表达调控主要与其启动子异常甲基化有关。5.常用甲基化检测方法中,每种方法各有其优缺点。（1）BSP法能精确分析每个CpG位点的甲基化状况,但较昂贵和繁琐;（2）MSP法灵敏度高,但要注意优化退火温度,防止产生假阳性结果;（3）COBRA法简便易行,但容易出现非甲基化偏性;（4）PCR产物直接测序适用于大规模检测的需要,但目前技术仍有待改进。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 原发性结直肠肿瘤中Hedgehog信号通路的配体依赖性活性研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二章 结直肠肿瘤中Hedgehog信号通路的表观调控机制研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第三章 基于亚硫酸氢盐修饰的几种常用甲基化检测方法初步评价
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果（论文发表）
• 致谢
• 统计学证明