论文摘要
背景和目的：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）具有免疫调节作用。淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）不仅介导细胞间粘附,还可影响淋巴细胞免疫功能。1磷酸鞘氨醇（S1P）既可以作为胞内第二信使,又可以作为细胞间信号分子通过与受体结合而发挥作用。我们前期研究发现G-CSF动员后CD4+T细胞LFA-1粘附力下降,并使CD4+T细胞免疫功能改变,可能影响急性移植物抗宿主病的发生；G-CSF动员不改变供者血清的S1P浓度,但增强单核细胞内S1P限速酶SphK的活性。结合文献报道S1P可以增强LFA-1的粘附力,S1P拮抗剂通过LFA-1和β7整合素增加淋巴细胞归巢。因此,我们推断动员后SIP/SIP受体信号可能也参与了G-CSF免疫调节网络。本研究通过分析G-CSF动员前后SIP/SIP受体信号的变化、S1P5对LFA-1粘附功能的影响以及CD4+T细胞G-CSF受体表达情况,研究探讨SIP/SIP受体信号在G-CSF诱导免疫耐受中的作用。方法：（1）采用Realtime RT-PCR和流式细胞术检测G-CSF动员前后S1P受体在1mRNA和蛋白水平的表达变化；采用Transwell趋化实验检测G-CSF动员前后CD4+T细胞对S1P趋化作用的变化；采用粘附实验检测S1P对动员后CD4+T细胞LFA-1粘附能力的影响；采用Western blot的方法检测G-CSF动员前后CD4+T细胞LFA-1磷酸化状态的变化。（2）在Jurkat细胞系中,用洛伐他汀抑制LFA-1信号,用CCK-8法检测抑制LFA-1后细胞增殖,PI和Annexin V检测细胞凋亡,用Realtime RT-PCR检测S1P5表达变化；采用SiRNA转染沉默Jurkat细胞S1P5,观察S1P5对Jurkat细胞增殖、凋亡以及对LFA-1磷酸化和粘附能力的影响。（3）为研究G-CSF是否可直接通过受体调节CD4+T细胞功能,我们采用刀豆蛋白诱导CD4+T细胞活化,用流式细胞术检测动员前后G-CSF受体的表达变化；CCK-8法检测体外G-CSF对CD4+T细胞及Jurkat细胞增殖的影响。结果：（1）G-CSF动员后CD4+T细胞的5种S1P受体,在1nRNA水平上,S1P5表达较动员前上调,S1P1-S1P4表达无明显差异；在蛋白水平上,S1P5在动员后CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞中表达均上调,其中CD4+T细胞变化幅度最大；动员后CD4+T细胞对S1P的迁移率较动员前下降；S1P不影响动员前CD4+T细胞LFA-1粘附率,但可降低动员后的CD4+T细胞LFA-1粘附率；G-CSF动员后CD4+T细胞LFA-1磷酸化降低。（2）抑制LFA-1可抑制细胞系Jurkat和K562细胞增殖、诱导凋亡,并减少Jurkat细胞S1P5的表达。沉默Jurkat细胞S1P5基因后,对Jurkat细胞增殖、凋亡以及LFA-1磷酸化均无明显影响,但可促进LFA-1粘附能力。（3）供者CD4+T细胞在动员前后均有G-CSF受体mRNA表达；G-CSF动员可抑制CD4+T细胞G-CSF受体表达；G-CSF体内、体外均可抑制刀豆蛋白诱导的CD4+T细胞增殖反应；G-CSF对CD4+细胞系Jurkat细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。结论：G-CSF动员后CD4+T细胞S1P5表达增加,可能导致CD4+T细胞对S1P趋化减弱并降低LFA-1的粘附能力。S1P5可能是LFA-1粘附能力的负调控因素。G-CSF可能通过其受体直接调节CD4+T细胞功能。
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