MnCl2对大鼠睾丸支持细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录及蛋白表达的影响

论文摘要

目的生殖健康是近些年讨论的热点,男性精液的质和量呈逐渐下降趋势,其影响因素是多方面的,环境污染是重要影响因素。在中国,由于生产工艺和技术的落后,以及管理不善,环保观念的薄弱,使得近些年的重金属污染情况日趋严重。锰作为重金属的一种,既是人体所需的微量元素之一,又是职业危害因素之一。锰参与人体的多种功能活动,微量的锰被机体吸收后,可进入睾丸组织参与精子的生成。锰缺乏时会出现性欲低下和不育,表现为生殖功能抑制,精子成熟受阻等；但过量的锰也会对雄性生殖系统产生影响,现有的研究表明,过量的摄入锰会对雄性生殖系统造成损伤,使睾丸萎缩、精子数量减少、畸形精子数增加等。该实验研究中,以原代培养大鼠睾丸支持细胞（Sertoli cell,SC）为模型,以氯化锰（MnCl2）为染毒物,用实时荧光定量PCR（real time Q-PCR）和Western blot方法检测MnCl2对支持细胞雄激素结合蛋白（Androgen binding protein,ABP）转铁蛋白（Transferrin,Tf）和抑制素B （Inhibin B.INH B）的mRNA转录水平和蛋白表达量的影响,探讨MnCl2对雄性生殖功能影响的作用机制,为进一步研究Mn对雄性生殖系统的毒性提供理论支持。方法1.支持细胞体外培养：选取18-20d的清洁级雄性Sprague Dawley大鼠,分离提取Sertoli细胞。2. Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞生长状态：将Sertoli细胞以细胞浓度为2.0×104个/ml接种于96孔培养板,每板接种6个复孔,在450 nm测吸光度,绘制细胞生长曲线。3.MTT法确定染毒浓度：以1.0×10-2 mol/L、1.0×10-3 mol/L、1.0×10-4 mol/L、1.0×10-5 mol/L、1.0×10-6 mol/L、1.0×10-7 mol/L、1.0×10-8 mol/L、1.0×10-9 mol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,培养24h,用酶标仪在492 nm测量吸光度,确定染毒浓度。4.荧光实时定量PCR法检测ABP、Tf和INH B mRNA的表达量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,染毒24h,提取Sertoli细胞的总RNA进行逆转录后,检测ABP、Tf和INH B mRNA的转录水平。5. Western blot法检测ABP, Tf和INHB的蛋白表达量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,提取Sertoli细胞的蛋白,用Western blot法检测ABP、Tf和INHB的蛋白相对表达量。结果1.细胞培养结果：通过两步酶法,提取的SD大鼠支持细胞存活率达到95%以上,培养48 h后细胞基本完全铺开,生长良好,经胰酶纯化后Sertoli细胞纯度达90%以上。2.CCK-8法测定结果：培养4-8 d的细胞数量相对比较稳定,代谢旺盛,选择培养至第5d的细胞进行研究。3.MTT法测定结果：检测各染毒组处理24 h后的Sertoli细胞OD值,经计算,IC50=200μmol/L选择1/4 IC5o、1/2 IC5o和IC50,即50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L为染毒浓度。4.荧光实时定量PCR结果：各浓度组Sertoli细胞ABP、Tf和INHBmRNA均能持续表达,三者的mRNA转录水平在各染毒组均降低,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。5. Western blot结果：ABP蛋白相对表达量在各染毒组均降低,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；Tf的蛋白相对表达量在100μmol/L和200μmol/L两个浓度组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；INH B的蛋白相对表达量在200μmol/L浓度组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论氯化锰在该染毒剂量下可降低Sertoli细胞ABP、Tf和INH B mRNA转录及蛋白的表达水平,提示氯化锰可能通过抑制ABP、Tf和INHB基因表达而损伤支持细胞功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词表
• 图和附表清单
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 Sertoli细胞分离、培养
• 3.2 Sertoli细胞生长状态
• 2染毒浓度确定'>3.3 MnCl₂染毒浓度确定
• 2对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录水平的影响'>3.4 MrCl₂对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录水平的影响
• 2对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB蛋白表达的影响'>3.5 MnCl₂对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB蛋白表达的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历 在校期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢