论文摘要
目的:构建携带人hIL-24Δ103基因的重组腺病毒载体,并检测其对A549细胞生长及凋亡的影响,为进一步研究白介素24细胞内信号通路奠定了基础。方法:本课题采用PCR技术以重组质粒Pgex-IL-24为模板扩增人白介素24 N端104-206位氨基酸残基编码序列,PCR产物连入pMD18-T载体,蓝白斑初步筛选,挑取白色菌落,经Kpn I和Xho I双酶切及测序鉴定正确后酶切并胶回收目的片段,亚克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中。鉴定正确的穿梭载体经Pme I酶切后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化BJ5183菌挑取阳性克隆经Pac I酶切鉴定正确。腺病毒载体经Pac I酶切后脂质体转染HEK293细胞包装并大量扩增Ad-hIL-24Δ103腺病毒,重组病毒感染A549细胞,MTT观察细胞活力,Hoechst33258染色及流式细胞术检测凋亡。Western blotting检测PKR、eIF-2α蛋白表达及活化。结果:通过PCR获得目的基因hIL-24Δ103,2%琼脂糖凝胶电泳显示目的片段大小约312bp。目的基因克隆入pMD18-T载体后,挑取阳性克隆经双酶切,PCR可见目的条带,测序正确。目的基因亚克隆至pAdTrack-CMV后双酶切及PCR鉴定正确。同源重组后腺病毒载体经Pac I酶切得到一条23kb左右的大片段和一条约4.5 kb的特征性小片段,表明重组腺病毒质粒构建成功。线性化的重组病毒质粒转染293细胞3d后荧光显微镜下可见大量细胞有EGFP表达,细胞出现病变效应,细胞核大,黏附力降低。取病毒上清作PCR鉴定可见hIL-24Δ103目的条带。Western blotting可检测到15kd处有一蛋白条带,为hIL-24Δ103蛋白,表明重组腺病毒包装成功。TCID法测病毒滴度为2×1010 PFU/mL。hIL-24Δ103重组腺病毒感染A549细胞后MTT检测细胞活力随病毒量增加而显著降低,相对细胞活力在10 PFU/mL时为0.95,25 PFU/mL时为0.71,50 PFU/mL时为0.47,100 PFU/mL时为0.20。Hoechst33258染色显示hIL-24Δ103重组腺病毒感染的A549细胞核深染、固缩、碎裂,出现典型的凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示hIL-24Δ103重组腺病毒处理组凋亡率为22.42±0.69,相比空病毒处理（1.25±0.53）组和PBS对照（1.03±0.37）组有明显统计学差异。Western blotting检测到hIL-24Δ103重组腺病毒处理组PKR和eIF-2α蛋白表达增加,并检测到磷酸化的PKR和eIF-2α蛋白,说明两者被hIL-24Δ103激活。结论:本实验成功构建携带增强型绿色荧光蛋白的人hIL-24Δ103重组腺病毒,病毒滴度高。hIL-24Δ103通过激活PKR和eIF-2α抑制A549细胞增殖,促进凋亡。
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