云芝糖肽（PSP）诱导Molt-4细胞凋亡过程中对TNFR1死亡受体通路调控的研究

论文摘要

云芝糖肽（PSP）是从中药云芝（Trametes versicolor）COV-1菌株菌丝体内提取的成分。作为国家II类新药,PSP被用于癌症病人减轻化疗放疗产生的毒副作用。体外研究证明PSP可以诱导人白血病细胞Mol-4发生凋亡现象。本课题就云芝糖肽（PSP）诱导白血病细胞Molt-4凋亡过程中对TNFR1死亡受体途径的调控作用进行研究。使用透射电镜观察400?g/mlPSP诱导Molt-4细胞凋亡的形态学特征,发现有染色质凝聚,细胞皱缩、凋亡小体形成及释放等典型的凋亡特征。流式细胞仪分析25、100、400?g/mlPSP作用Molt-4细胞48h,均能够上调死亡受体TNFR1阳性细胞比率（PG）,分别增加0.32%、4.08%、11.27%;用400?g/mlPSP作用12、24、36、48h后也均能够上调PG,分别增加5.71%、36.48%、37.25%、40.88%。加入2.5?g/100?l抗TNFR1抗体可减少16%因PSP诱导的细胞死亡。ELISA检测显示死亡配体TNF-?浓度并未受PSP调控。免疫沉淀实验表明PSP可以促进TRADD蛋白与死亡受体TNFR1结合,形成凋亡复合物。免疫荧光标记发现PSP能够促使FADD聚集至细胞膜内侧。这些现象均显示PSP是通过上调TNFR1死亡受体的表达量,募集胞内TRADD、FADD蛋白,从而使死亡信号转导至细胞内部,促进细胞凋亡。免疫印迹进一步发现,Bid分子并未受到PSP调控,提示PSP调控的TNFR1死亡受体途径并未通过Bid蛋白与线粒体途径相关联。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 凋亡及其信号转导机制
• 1.1.1 细胞凋亡及其形态学特征
• 1.1.1.1 凋亡（Apoptosis）——细胞主动结束生命的死亡方式
• 1.1.1.2 凋亡形态学特征
• 1.1.1.3 凋亡生化特征
• 1.1.1.4 凋亡现象的生物学意义
• 1.1.2 凋亡信号的转导机制
• 1.1.2.1 线粒体途径——内源性凋亡途径
• 1.1.2.2 死亡受体途径——外源性凋亡途径
• 1.1.2.3 死亡受体途径与线粒体途径之间的“通讯员”
• 1.2 TNFR1 死亡受体途径
• 1.2.1 死亡受体信号转导途径
• 1.2.1.1 死亡受体及其配体
• 1.2.1.2 死亡受体信号转导途径
• 1.2.2 TNFR1 死亡受体及其凋亡转导途径
• 1.2.3 TNFR1 死亡受体途径中的关键蛋白
• 1.3 死亡受体途径在临床治疗上的应用
• 1.4 云芝糖体（PSP）及其凋亡信号转导机制的研究进展
• 1.4.1 云芝与云芝糖肽（PSP）
• 1.4.1.1 云芝
• 1.4.1.2 云芝糖肽（PSP）及其理化性质和生物活性
• 1.4.2 云芝糖肽（PSP）抗肿瘤机制的研究进展
• 1.4.2.1 PSP 阻碍肿瘤细胞周期进程
• 1.4.2.2 PSP 诱导肿瘤细胞凋亡
• 1.5 课题的提出、目的和内容
• 1.5.1 课题提出
• 1.5.2 研究目的
• 1.5.3 课题设计和课题内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 云芝糖肽（PSP）对TNFR1 死亡受体及其配体的调控作用
• 2.1.1 白血病细胞Molt-4 的复苏、培养、接种及10mg
• 2.1.1.1 实验仪器
• 2.1.1.2 试剂及配制方法
• 2.1.1.3 实验方法
• 2.1.2 透射电镜观察PSP 诱导Molt-4 细胞凋亡的形态学变化
• 2.1.2.1 实验仪器
• 2.1.2.2 试剂及配制方法
• 2.1.2.3 实验方法
• 2.1.3 流式细胞仪分析细胞膜表面TNFR1 蛋白
• 2.1.3.1 实验仪器
• 2.1.3.2 试剂及配制方法
• 2.1.3.3 实验方法
• 2.1.4 抗体干扰实验
• 2.1.4.1 实验仪器
• 2.1.4.2 试剂及配制方法
• 2.1.4.3 实验方法
• 2.1.5 ELISA 方法检测TNF-?的表达量
• 2.1.5.1 实验仪器
• 2.1.5.2 试剂及配制方法
• 2.1.5.3 实验方法
• 2.2 云芝糖肽（PSP）对TNFR1 死亡受体途径中相关蛋白的调控作用
• 2.2.1 免疫沉淀法检测TNFR1 复合物中TRADD 蛋白
• 2.2.1.1 实验仪器
• 2.2.1.2 试剂及配制方法
• 2.2.1.3 实验方法
• 2.2.2 免疫荧光法观察衔接蛋白FADD 细胞内募集现象
• 2.2.2.1 实验仪器
• 2.2.2.2 试剂及配制方法
• 2.2.2.3 实验方法
• 2.3 探究云芝糖肽（PSP）凋亡信号转导中死亡受体途径与线粒体途径之间的关联
• 2.3.1 免疫印迹法分析Bid 和tBid 蛋白的表达
• 2.3.1.1 实验仪器
• 2.3.1.2 试剂及配制方法
• 2.3.1.3 实验方法
• 第三章 云芝糖肽（PSP）对TNFR1 死亡受体通路的调控作用
• 3.1 云芝糖肽（PSP）对TNFR1 死亡受体及其配体的调控作用
• 3.1.1 透射电镜观察PSP 诱导Molt-4 细胞凋亡的形态学变化
• 3.1.1.1 透射电镜观察PSP 诱导Molt-4 细胞凋亡的形态学变化结果
• 3.1.1.2 分析与讨论
• 3.1.2 流式细胞仪分析细胞膜表面TNFR1 蛋白
• 3.1.2.1 流式细胞仪检测PSP 对细胞膜表面TNFR1 蛋白含量调控的结果
• 3.1.2.2 分析与讨论
• 3.1.3 抗体干扰实验
• 3.1.3.1 抗体干扰实验的结果
• 3.1.3.2 讨论
• 3.1.4 ELISA 方法检测TNF-?的表达量
• 3.1.4.1 ELISA 方法检测TNF-?的表达量的结果
• 3.1.4.2 分析与讨论
• 3.1.5 小结
• 3.2 云芝糖肽（PSP）对TNFR1 死亡受体途径中相关蛋白的调控作用
• 3.2.1 免疫沉淀法检测TNFR1 复合物中TRADD 蛋白
• 3.2.1.1 免疫沉淀法检测TNFR1 复合物中TRADD 蛋白的结果
• 3.2.1.2 分析与讨论
• 3.2.2 免疫荧光法观察斜接蛋白FADD 细胞内募集现象
• 3.2.2.1 免疫荧光法观察斜接蛋白FADD 细胞内募集现象的结果.
• 3.2.2.2 分析与讨论
• 3.2.3 小结
• 3.3 探究云芝糖肽（PSP）凋亡信号转导中死亡受体途径与线粒体途径之间的关联
• 3.3.1 免疫印迹法分析Bid 和tBid 蛋白的表达
• 3.3.1.1 免疫印迹法分析Bid 和tBid 蛋白表达的结果
• 3.3.1.2 分析与讨论
• 总结
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果