2型登革病毒特异性单克隆抗体保护作用的实验研究

论文摘要

登革病毒（Dengue Virus,DENV）是黄病毒属、有包膜的单股正链RNA病毒,由于包膜蛋白的抗原性不同,又分为四种血清型,即DENV1～4。DENV主要以埃及伊蚊和白纹伊蚊为媒介而广泛流行于热带和亚热带地区。每年,DENV会导致数百万人感染,引起登革热（dengue classical fever,DF）和登革出血热/休克综合症（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS）。DF是自限性发热性疾病;而DHF/DSS则是威胁患者生命的重症,其主要特征是血管通透性显著增加,导致血浆渗漏。每年有大约50万DHF/DSS患者需要及时入院治疗,否则病死率高达50 %。然而,DHF/DSS的发病机制,以及DENV与宿主细胞之间相互作用的机制尚不清楚。虽然在过去几十年中,研究者从多方式、多角度入手研制DENV的疫苗,但至今仍没有预防和治疗DENV感染的疫苗和药物。无论是减毒活疫苗、多价疫苗,还是核酸疫苗、蛋白成分疫苗都遇到DENV流行株抗原变异、抗体增强效应（antibody dependent enhancement,ADE）等障碍而进展缓慢。基于近年来DHF/DSS患者数量明显增加和上述研究现状,被动免疫或者说是治疗性单克隆抗体（Monoclonal antibodies,mAb）再次引起了研究者的关注。早在1907年人体抗血清就被用来治疗麻疹病毒感染的患者。20世纪40年代起,从高免疫的血清中提取的免疫球蛋白来预防和治疗病毒感染成为热点,部分制品至今还被用于临床治疗。而特异性不高、成分复杂和潜在的疾病传播途径等缺陷极大的限制了此类生物制剂的使用。1982年mAb技术的出现后,研发高中和特性的mAb用于预防和治疗病毒性疾病就受到研究者的青睐。特别是进入21世纪以来,生物技术和工业技术的进步,大量的治疗性mAb药物已进入临床实验或已应用于临床,成为生物制药中增长最快的部分。治疗性mAb成为防治病毒的新手段,新焦点。因此,无论从研究DENV病理机制角度,还是从研发治疗性mAb角度,获得多株特异性mAb具有重要意义。特别是具有高中和能力的mAb,是研究致病机制的免疫学工具和治疗性mAb的基本材料。本试验首先通过蔗糖密度梯度高速离心获得纯化的DENV2（Tr1751）株的具感染活性的病毒颗粒,并利用纯化的病毒颗粒免疫SPF级BALB/c小鼠。之后通过杂交瘤细胞技术获得分泌DENV特异性mAb的杂交瘤细胞株10株,78#、1E7、2B10、6C1、6H3、7F7、8B6、8F12、8H1、8H4。然后分别对10株mAb进行性质鉴定,其中具有中和能力的mAb有7株（2B10、78#、1E7、7F7、8B6、8F12、8H4）包括2株中和能力较高的mAbs（78#、8F12）,并对其在体内外的保护活性进行验证。结果提示通过全病毒免疫来制备中和抗体具有一定的优势,获得的mAbs也为后续研究DENV的致病机理,以及治疗性mAb的研发提供了有利的免疫学工具。本研究主要结果与结论如下:1.建立了纯化的DENV2的方法,获得具有感染性的纯化病毒本实验通过DENV2的天然中介宿主细胞白纹伊蚊C6/36细胞增殖出大量病毒,并测定病毒滴度。除去细胞碎片后,使用PEG-8000对病毒进行浓缩,测定浓度病毒滴度。最后通过蔗糖密度梯度高速离心来获得纯化的DENV2具感染性的病毒颗粒,并通过病毒滴度测定和SDS-PAGE来验证纯化病毒及其含量。通过不同蔗糖密度梯度比较,确定了DENV2主要沉降区带,建立了纯化DENV的方法,并制备了一定量的纯化病毒供下述实验使用。2.通过杂交瘤技术获得10株鼠源性抗DENV2的mAbs利用纯化的DENV2病毒颗粒免疫SPF级的BALB/c小鼠10只,细胞融合前取小鼠尾血进行细胞爬片间接免疫荧光染色,检测特异性抗体产生情况。无菌条件下取出免疫效果好的小鼠脾脏,机械分离为单个细胞后与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0在融合剂PEG-4000的作用下形成杂交瘤细胞。通过HAT培养筛选、间接ELISA阳性筛选和反复单克隆化等方法,获得了10株分泌DENV2特异性mAbs的稳定杂交瘤细胞株,命名为78#、1E7、2B10、6C1、6H3、7F7、8B6、8F12、8H1、8H4。以无血清1640培养液分别培养各杂交瘤细胞来获得浓度较低的mAb或通过小鼠腹腔注射培养来获得大量较高浓度的mAb腹水,供下述实验使用。3. 10株mAbs性质的鉴定（1）间接ELISA验证10株mAbs的特异性。以纯化的DENV2为抗原包被96孔板,同时用1 % BSA包被96孔板作为阴性对照。以mAb上清液或腹水为一抗,HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗,OPD显色。终止显色后测定OD492nm。以吸光值大于对照值2.1倍为阳性。制备的10株mAbs上清或腹水反映强弱各不相同,但均显示为阳性。（2）通过间接ELISA进行抗体饱和曲线的绘制。实验步骤同前,首先确定抗原最适包被浓度,然后将各株mAb腹水倍比稀释后作为一抗,显色后绘制OD492nm曲线,通过分析抗体饱和曲线得出各株抗体饱和稀释度。对于识别相同病毒蛋白,并且抗体亚型相同的mAbs,我们通过抗体叠加实验来验证其识别的抗原位点是否重叠。将这些mAbs稀释到各自的饱和浓度后,分别进行ELISA叠加实验,结果显示均出现较明显的叠加阳性,证实它们识别不同的病毒抗原位点。（3）间接免疫荧光实验测定各mAb对天然病毒抗原的识别情况。将感染DENV2后发病的幼鼠脑制成组织切片进行间接免疫荧光测定,发现8株mAbs（78#、1E7、2B10、6C1、7F7、8B6、8F12、8H4）能出现特异性荧光,而2株mAbs（6H3、8H1）没有特异性反应出现。（4）Western-blot确定各株mAb识别的病毒蛋白。纯化病毒经过SDS-PAGE后,半干转印到醋酸纤维膜上,按泳道剪条后,分别孵育各mAb,以HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗,DAB显色。10株mAbs中有6株（78#、1E7、2B10、8B6、8F12、8H1）识别DENV2 E蛋白,1株（6C1）识别非结构蛋白NS3,2株（8H1、6H3）识别非结构蛋白NS5,1株（7F7）无特异性反应条带出现。（5）其它指标:通过Sigma抗体分型试剂盒对各株mAb的抗体型和亚型进行鉴定。通过Giemsa染色确定杂交瘤细胞的染色体数量,检测杂交瘤细胞传代或复苏后的细胞稳定状态。4. PRNT测定10株mAbs的中和活性以非洲绿猴Vero细胞为测试细胞,mAb-DENV2混合物为感染源,正常鼠血清（normal mouse sera,NMS）-DENV2混合物为阴性对照,测定50 %病毒中和浓度——PRNT50。待Vero细胞在24孔板中单层覆盖生长后,将mAb（或NMS）倍比稀释1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320。加入等体积的病毒稀释液后,mAb（或NMS）的实际稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640。控制加入的病毒量,1 ml混合物中含有约1000 PFU的DENV2。mAb-DENV2（或NMS- DENV2）混合物37°C水浴1 h后,每孔200μl加入各孔中37°C孵育1.5 h。每孔约含有200 PFU的病毒和不同稀释度的抗体（或NMS）。之后以含1.2 %的甲基纤维素的MEM培养基培养7天,再通过结晶紫染色对病毒形成的噬斑（Plaque）进行计数。通过比对相同稀释度NMS的阴性孔,观察各株mAb有无中和作用,并计算中和抗体的PRNT50值。具有中和能力的mAb有7株:78#（1:60）、1E7（1:30）、2B10（1:35）、7F7（1:20）、8B6（1:30）、8F12（1:40）、8H4（1:15）。其中具有较高中和能力的2株mAbs:78#和8F12,两者混合后的PRNT50达到1:80。5. BALB/c乳鼠保护实验以BALB/c新生乳鼠（生后第2天）为DENV2挑战及抗体体内保护的研究对象,以体外实验中具有较高中和能力的78#和8F12 mAbs为实验对象,NMS为阴性对照。将mAb-DENV2或NMS-DENV2混合物37°C水浴1 h后,通过乳鼠脑内注射,进行病毒挑战实验。在对高低两个病毒进入量104 PFU和500 PFU进行比较的同时,分别对两株mAbs的体内保护性进行研究。发现它们均在一定程度上起到保护作用,乳鼠发病和死亡时间均比对照组延后。特别是在病毒进入量较低时,保护作用更为明显。在上述实验的基础上,将两株mAbs进行“cocktail”组合实验。取500 PFU的病毒进入量,mAbs-DENV2于37°C水浴1 h后注射。结果显示抗体的保护作用大幅度提高。乳鼠发病和死亡时间比对照组延后更显著,并且有16.7 %的乳鼠被彻底保护（存活超过2周的观察期）。总之,本实验建立了通过蔗糖密度梯度高速离心来纯化DENV2的方法,并以纯化病毒为抗原免疫BALB/c小鼠。通过免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得了10株DENV2特异性的mAbs。经过性质鉴定,我们对10株mAbs所识别的病毒蛋白、抗体饱和度、免疫学活性等多方面进行性质鉴定。同时,通过PRNT对它们的中和特性进行检测。在7株具有中和能力的mAbs中,78#和8F12具有较高的中和能力。进而又对这2株mAbs进行了BALB/c乳鼠保护实验,结果提示它们具有一定的保护作用,而两者的混合物保护作用更明显。因此,10株mAbs是进一步研究DENV2感染机制的有效免疫学工具。同时,具有较好中和能力的mAbs也为后续研究治疗性mAb的提供了初步的材料。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 2 型登革病毒特异性单克隆抗体保护作用的实验研究
• 前言
• 第一章 2 型登革病毒单克隆抗体的制备
• 实验材料
• 第一节 登革病毒颗粒的纯化
• 前言
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 2 型登革病毒单克隆抗体的制备
• 前言
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第三节 登革病毒特异性单克隆抗体特性的鉴定
• 前言
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 特异性单克隆抗体中和病毒作用的实验研究
• 实验材料
• 第一节 特异性单克隆抗体保护作用的体外实验研究
• 前言
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 特异性单克隆抗体保护作用的动物实验研究
• 前言
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 抗病毒单克隆抗体研究现状和应用前景
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表和撰写的文章
• 附录1：实验技术、材料
• 附录2：英文论著稿件