羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定

论文摘要

布鲁氏菌病是由胞内寄生革兰氏阴性菌--布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。作为一种重要的人畜共患病,布鲁氏菌病给人类健康和畜牧业的发展带来了巨大危害。长期以来,因为现有疫苗缺乏诊断标记以及尚未开发出有效的鉴别诊断抗原,导致疫苗免疫动物和临床患病动物难以鉴别,使患病动物在自然群体中长期存在,阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。所以迫切需要加强安全、有效、可鉴别疫苗的研究以及对现有检测诊断技术的改进。在国内外研究的基础上,从16M膜蛋白中选取9个蛋白,分别为OMP31、BP26、L7/L12、BCSP31、Dnak、cuznSOD、GroEL、GroES和P39。利用PCR扩增方法获得目的基因,用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段。将限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切后的目的片段与同样双酶切的表达载体连接,转化DH5a感受态细胞,并通过PCR扩增、酶切鉴定和序列测定鉴定重组质粒,结果表明9个重组表达质粒成功构建,且重组质粒中携带的目的基因编码框完全正确。成功转化Rosetta感受态细胞,获得9个转化菌株,然后摸索含有重组质粒的表达菌株在不同收菌时间、不同IPTG浓度诱导下目的蛋白表达情况,SDS-PAGE电泳检测结果显示目的蛋白在大肠杆菌中获得了大量表达。用临床牛布鲁氏菌阳性血清进行Western-blot分析,9种表达蛋白均发生了阳性反应。对表达产物用Ni螯合亲和层析法进行纯化,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,用临床牛布鲁氏菌阳性血清为一抗,用HRP标记的羊抗牛IgG为二抗,最后建立了以BP26蛋白为抗原检测布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,阳性血清检出率为96%,验证了该蛋白良好的免疫原性以及作为诊断抗原的潜力。将纯化的His-OMP31、His-BP26、His-L7/L12、His-BCSP31、His-Dnak、His-cuznSOD、His-GroEL、His-GroES、His-P39蛋白与佐剂乳化后背部皮下免疫小鼠,初免使用完全弗氏佐剂,再免使用不完全弗氏佐剂。结果证明上述重组蛋白均能产生一定程度的免疫保护力,其中OMP31、BP26、GroEL、GroEs、P39蛋白免疫保护效果较好,该结果为布鲁氏菌亚单位疫苗或DNA疫苗的研究开发奠定了一定的基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 英文缩写词表
• 文献综述
• 1 布鲁氏菌病概述
• 2 布鲁氏菌的流行状况
• 3 布鲁氏菌病的防制措施
• 4 布鲁氏菌病的诊断现状
• 5 布鲁氏菌的免疫方面
• 6 布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展
• 7 本研究的目的意义
• 第一部分 布鲁氏菌部分菌体蛋白重组表达质粒的构建及诱导表达
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 菌株和菌种
• 1.1.3 质粒
• 1.1.4 引物合成
• 1.1.5 试验所用试剂及配制
• 1.1.6 所需的基本溶液
• 1.1.7 DNA 提取所用溶液
• 1.1.8 肠杆菌感受态细胞的制备及转化所用溶液
• 1.1.9 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.1.10 制备重组外膜蛋白相关试剂及其配制
• 1.1.11 SDS-PAGE 试剂的配制
• 1.2 重组质粒的构建
• 1.2.1 布鲁氏菌16M 基因组的提取
• 1.2.2 PCR 引物的设计与合成
• 1.2.3 降落PCR 扩增目的基因
• 1.2.4 PCR 产物的回收纯化
• 1.2.5 目的片段的双酶切
• 1.2.6 表达载体pET-21b 和PET-32a 的双酶切
• 1.2.7 连接
• 1.2.8 转化
• 1.3 重组质粒的鉴定
• 1.3.1 PCR 鉴定
• 1.3.2 双酶切鉴定
• 1.3.3 测序
• 1.4 重组表达质粒的诱导表达与条件优化
• 1.4.1 诱导表达
• 1.4.2 蛋白表达条件的优化
• 1.5 结果
• 1.5.1 目的基因的获得
• 1.5.2 重组质粒的双酶切鉴定
• 1.5.3 测序结果与序列分析
• 1.5.4 重组表达质粒的表达
• 1.5.5 蛋白表达条件的优化
• 1.6 讨论
• 1.6.1 关于蛋白的表达
• 小结
• 第二部分 重组蛋白的纯化与抗原性鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 蛋白纯化用溶液及其配制
• 2.1.2 Western-blot 用溶液及其配制
• 2.1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）相关溶液
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 Western-blot 鉴定
• 2.2.2 蛋白的纯化
• 2.2.3 利用重组蛋白检测阳性布鲁氏菌抗体间接ELISA 方法的建立
• 2.3 结果
• 2.3.1 Western-blot
• 2.3.2 目的蛋白的纯化：亲和层析方法
• 2.3.3 BP26-ELISA 检测布鲁氏菌抗体方法的建立
• 2.4 讨论
• 小结
• 第三部分 重组蛋白的免疫保护力研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 动物分组与免疫
• 3.2.2 免疫保护评价
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• ABSTRACT