番茄GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶基因的克隆与功能分析

论文摘要

赤霉素（GA）是一类重要的植物激素，具生物活性的GA作用于高等植物的整个生命周期。包括种子萌发、茎和根的伸长、叶片伸展、表皮毛发育、花粉管伸长、花和果实的发育等。而且植物也通过调节内源赤霉素的生物合成来介导自身对环境因子的应答。因此，赤霉素生物合成的调控对植物的发育及其对环境的适应有着极为重要的意义。以前在农业或园艺学上对植株的调控主要是采用一些化学的方法。在了解了GA生物合成途径的基础上就可以利用生物技术从基因水平上对植株特定组织的特定基因进行调控来控制植株的生长。目前赤霉素生物合成途径中大部分的关键酶基因已经被克隆，这些基因的克隆为我们探讨GA在植物根、茎、叶、花和果实的发育过程中的作用机理创造了条件。GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶是赤霉素合成代谢途径中的两个关键酶，都由多基因家族编码，GA 20-氧化酶促进活性GA的合成而GA 2-氧化酶将活性的GA转化为非活性GA。对GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶基因的表达进行调控，将影响活性GA的合成代谢，从而影响植物的生长发育。目前，番茄的GA 2-氧化酶基因还没有被克隆。对GA20-氧化酶基因家族各个成员分别在植物生长发育中的功能的研究也没有报道。番茄是研究植物生长发育比较好的模式植物，以番茄为材料研究GA2-oxidase和GA 20-oxidase基因家族不同成员的生物学功能，对全面了解赤霉素在植物根、茎、叶、花、果等的生长、发育以及形态建成过程中所发挥的作用，阐明其作用的可能的分子机理有着重要的理论意义。同时对番茄生产中合理利用赤霉素来调控番茄植株的生长发育也具有实际的指导意义。本研究以番茄这一重要的蔬菜作物为材料，克隆了编码番茄GA 20-氧化酶的3个家族成员，利用RNA干涉技术分别调控3个基因的表达，从分子水平，植株表型以及组织显微结构、生理生化指标测定等方面进行分析，初步确定了3个GA 20-氧化酶在植物生长发育过程中的主要功能；克隆和鉴定番茄GA 2-oxidase2全长基因，分析了其序列特征。构建了干涉表达载体，从分子水平进行分析阐明了该基因可能的作用机理。本研究获得的主要结果如下：1．克隆了番茄赤霉素生物合成途径中的GA 2-氧化酶2（GA2ox2）基因的全长cDNA。其GenBank登录号为EF017805，测序结果表明该cDNA全长1203 bp，包含一个长为969 bp的完整开放读码框，编码322个氨基酸。2．对3个GA 20-oxidase和GA 2-oxidase2基因在番茄不同组织器官中的表达进行了半定量RT-PCR分析，结果表明这两个基因在番茄根、茎、叶、花、果实等各种组织器官中呈组成型表达，但不同组织的表达水平有差异。3．构建了GA 20-oxidase和GA 2-oxidase2基因的RNAi表达载体共4个。利用农杆菌介导的遗传转化方法将RNAi表达载体导入常规番茄品种中蔬五号中，共获得卡那霉素抗性转化植株85棵。PCR检测和Southern杂交结果表明，外源基因已经整合到番茄基因组中，其拷贝数1-6个不等。4．对RNAi转基因植株中目标基因的表达量进行半定量RT-PCR分析。结果显示，靶基因在相应RNAi转基因植株不同组织器官中的表达量有不同程度的降低，单个GA 20-oxidase基因家族成员的表达受抑制时其它成员的表达不受影响。说明RNAi能特异有效的抑制目标基因的表达。5．采用EHSA对RNAi转基因植株的赤霉素含量进行了测定，结果表明：抑制GA20ox1和GA20ox2基因的表达显著降低植物体内GA的合成；抑制GA20ox3基因的表达对GA的合成影响较小。GA 2-oxidase2基因的抑制对植物GA的合成没有影响。6．对转基因植株进行了表型的观测和相关形态指标以及生理指标的测定。结果表明：GA20ox1和GA20ox2 RNAi转基因植株表现半矮化，叶片变小增厚，叶色加深；叶绿素含量增加，光合效率增强。GA20ox3 RNAi转基因植株侧根数量减少，长度略增加。3个GA20ox的RNAi转基因植株均能正常开花结果，形成正常的种子。说明抑制GA20ox的表达对植物营养器官的生长发育产生影响，而对生殖器官的发育影响不大。7．有些植物赤霉素严谨型突变体种子败育，种子发芽率降低。对3个GA 20-oxidase RNAi转基因植株的种子进行了发芽实验。结果表明，抑制GA20ox的表达影响种子萌发，种子萌发率降低，萌发时间推迟。8．转基因植株表现半矮化，叶片变小增厚。茎和叶的组织显微结构显示：GA20ox1和GA20ox2 RNAi转基因植株叶片叶肉细胞增大，栅栏组织发达，排列紧密，叶厚度显著增加；茎的木质部厚度减小。GA20ox3 RNAi转基因植株茎和叶的显微结构与对照相似。说明GA20ox1、GA20ox2的抑制表达影响了茎和叶中不同组织细胞的分裂和形成，GA20ox3的抑制对茎、叶细胞结构影响不大。9．植株矮化，叶片增厚是植物抗逆性提高的两个表观特征。对GA 20-oxidase RNAi转基因植株后代的抗旱特性进行了初步观测，结果表明抑制GA20ox1和GA20ox2基因的表达，其RNAi转基因植株后代的抗性有一定程度的提高。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 番茄概述
• 1.1.1 番茄的植物学分类
• 1.1.2 番茄的研究意义
• 1.2 赤霉素的研究进展
• 1.2.1 赤霉素简介
• 1.2.2 赤霉素的生物学功能
• 1.2.3 赤霉素的合成代谢途径
• 1.2.3.1 赤霉素生物合成前体—牻牛儿牻牛儿焦磷酸的形成途径
• 1.2.3.2 赤霉素生物合成的基本途径
• 1.2.4 赤霉素生物合成途径中的关键酶
• 1.2.4.1 珂巴焦磷酸合成酶（CPS）
• 1.2.4.2 内-贝壳杉烯合成酶（KS）
• 1.2.4.3 内-贝壳杉烯氧化酶（KO）
• 1.2.4.4 内-贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）
• 1.2.4.5 GA 20-氧化酶（GA 20-oxidase）
• 1.2.4.6 GA 3-氧化酶（GA 3-oxidase）
• 1.2.4.7 GA Z-氧化酶（GA Z-oxidase）
• 1.2.5 赤霉素生物合成与代谢的调控
• 1.2.5.1 发育阶段对 GA生物合成的调节
• 1.2.5.2 环境因素对 GA生物合成的调节
• 1.2.5.3 生物活性 GA的水平对 GA生物合成的调节
• 1.2.5.4 其它植物激素对 GA生物合成的调节
• 1.2.6 赤霉素在植物体内的运输
• 1.2.7 赤霉素的信号转导
• 1.2.7.1 GA信号转导途径中的组成元件及其功能
• 1.2.7.2 GA的信号转导模型
• 1.3 RNA干涉
• 1.3.1 RNA干涉的作用原理
• 1.3.2 RNA干涉的特点
• 1.3.3 RNA干涉技术在基因功能研究上的应用
• 1.4 本研究的目的意义和主要内容
• 第二章 番茄 GA 20-氧化酶基因的克隆及功能分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 引物设计
• 2.1.5 基本培养基
• 2.1.6 常用溶液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因克隆、测序及分析
• 2.2.2 RNA干涉表达载体的构建
• 2.2.3 番茄的遗传转化
• 2.2.4 植物总DNA的提取
• 2.2.5 植物总RNA的提取
• 2.2.6 转基因番茄植株的分子检测
• 2.2.6.1 转基因番茄植株PCR检测
• 2.2.6.2 转基因番茄植株的Southern杂交分析
• 2.2.7 半定量RT-PCR分析
• 2.2.8 转基因番茄植株赤霉素含量的测定
• 2.2.9 转基因番茄植株形态指标的测定
• 2.2.10 转基因番茄植株生理指标的测定
• 2.2.10.1 电导率的测定
• 2.2.10.2 叶片相对含水量
• 2.2.10.3 叶绿素的提取和测定
• 2.2.10.4 脯氨酸含量测定
• 2.2.10.5 光合速率测定
• 2.2.11 种子萌发
• 2.2.12 石蜡切片的制作和显微结构的观测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 番茄 GA 20-氧化酶基因的序列比对
• 2.3.2 RNA干涉表达载体的构建
• 2.3.3 转基因植株的获得
• 2.3.4 转基因番茄植株的分子检测
• 2.3.4.1 转基因植株的PCR检测
• 2.3.4.2 转基因植株的Southern杂交分析
• 2.3.5 番茄 GA 20-氧化酶基因在不同器官中的表达分析
• 2.3.6 RNAi转基因植株的表型变化
• 2.3.6.1 RNAi转基因植株茎和叶的形态变化
• 2.3.6.2 GA20ox3 RNAi转基因植株根的形态变化
• 2.3.7 GA 20-氧化酶基因在转基因植株不同器官中的表达分析
• 2.3.8 赤霉素含量的测定和分析
• 2.3.9 转基因植株形态指标的测定
• 2.3.10 转基因植株叶片和茎的显微结构
• 2.3.11 生理指标的测定
• 2.3.11.1 叶绿素含量的测定
• 2.3.11.2 光合效率测定
• 2.3.12 种子萌发率的测定
• 2.3.13 转基因植株抗旱性初步观察
• 2.3.13.1 叶片相对含水量
• 2.3.13.2 叶片伤害率
• 2.3.13.3 脯氨酸的测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 RNAi的特异性和有效性
• 2.4.2 GA 20-oxidase基因的功能分析
• 2.4.3 通过调控 GA 20-氧化酶的表达提高植物抗逆性
• 第三章 番茄GA 2-氧化酶2基因的克隆及分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株、质粒和主要试剂
• 3.1.3 引物设计
• 3.2 方法
• 3.2.1 RACE扩增
• 3.2.2 基因克隆、测序及分析
• 3.2.3 转基因植株的分子鉴定
• 3.2.4 赤霉素含量的测定
• 3.2.5 转基因植株的形态观察
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 番茄 GA 2-oxidase2基因全长cDNA的克隆
• 3.3.2 番茄 GA 2-oxidase2基因的序列分析
• 3.3.3 番茄 GA 2-oxidase2在不同器官中的表达模式
• 3.3.4 RNAi表达载体的构建
• 3.3.5 番茄遗传转化
• 3.3.6 转基因植株的分子检测
• 3.3.6.1 转基因植株的PCR检测
• 3.3.6.2 Southern杂交检测
• 3.3.7 转基因番茄的表型观测
• 3.3.8 转基因植株的RT-PCR检测
• 3.3.9 赤霉素含量的测定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 生物信息学在番茄基因克隆中的应用
• 3.4.2 GA 2-oxidase2的多基因家族现象
• 第四章 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一: 质粒的小量提取方法
• 附录二: 植物DNA的小量法提取程序
• 附录三: Trizol一步法提取植物总RNA方法
• 附录四: Southern Blotting程序
• 附录五: 赤霉素的提取与测定
• 附录六: 研究生期间已发表或接受的论文及会议论文摘要