SARS-CoV非结构蛋白的表达、纯化及其在SARS病人血清抗体水平检测中的应用

论文摘要

SARS冠状病毒（SARS-CoV）是严重急性呼吸综合症（SARS）发生的病因,它是一种与现已知的其他冠状病毒不同的新型冠状病毒。除含有已知的四个结构基因外,SARS-CoV还有能编码3a、3b、7a等功能未知基因的ORF,认为它们编码一些非结构蛋白。为探索在SARS病人体内是否存在这些非结构蛋白的抗体和为以后研究3a、3b、7a蛋白的结构和生物学功能提供线索和工具。本实验首先克降SARS-CoV（BJ01）的3a、3b、7a基因和结构基因N,构建pET28a-N、pGEX6P-1-3a、pGEX6P-1-3b、pGEX6P-1-3a(（157-274aa）、pGEX6P-1-3b（81-154aa）原核表达载体,转化到大肠杆菌中进行融合蛋白的表达,经Western blot鉴定后,融合蛋白经SDS-PAGE或亲和层析纯化后包被96孔板,对10个SARS病人和正常人血清内抗体水平进行ELISA检测,结果显示,在病人体内有很高水平的N蛋白抗体,病人血清对的带GST标签的3a、3b融合蛋白也有反应,但是,病人血清对包被的载体蛋白GST也略有反应。为排除融合蛋白中载体蛋白对ELISA结果的影响,重新构建pET32a-3a（157-274aa）、pET32a-3b（81-154aa）、pET32a-7a（17-101aa）表达载体,进行表达,并利用thrombin切除融合蛋白中的载体蛋白,SDS-PAGE纯化后再次进行ELISA检测,以450nm处病人血清对蛋白的反应值与正常人血清对蛋白的反应值的比值大于2.1作为阳性判定标准。结果:在21份临床确诊SARS病人的血清样本中,有20个样本对N蛋白有强阳性反应,检出率为95.2%。对3a有16个样本有较强阳性反应,检出率为76.2%。对7a有12个样本有阳性反应,检出率为57.1%。对3b蛋白则只有7例显示是阳性,结果提示:在SARS病人血清中存在SARS-N、3a的抗体,可能有7a蛋白和3b蛋白的抗体,推测在病毒感染病人体内有非结构蛋白3a的表达。在另外10个病人血清对3a、3b、7a和N蛋白抗体ELISA检测实验中发现病人血清对前三个蛋白的反应强弱程度存在相关性,统计学分析结果显示有统计学意义。在本实验:克隆得到SARS-CoV的3a、3b、7a基因,构建了它们的原核表达载体,表达、纯化得到目的蛋白,建立以非结构蛋白作为包被抗原检测SARS病人血清抗体水平的间接ELISA法,为SARS临床诊断实验研究提供新的研究策略和以后对这些非结构基因开展研究工作提供工具和打下基础。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 SARS-CoV（BJ01）N、3a、3b、7a基因原核表达载体构建
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 第二部分 蛋白表达、鉴定和纯化
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 第三部分 病人血清抗体水平ELISA检测
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 发表论文