论文摘要
本研究以沼泽绿牛蛙为实验材料,第一步对沼泽绿牛蛙的4种不同诱导方式所产生的4种产物进行了抗菌活性实验,结果表明4种诱导产物对金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌有一定的抑菌活性,但对酵母菌抑菌活性不明显。其抑菌活性由强到弱依次是电击后蛙皮分泌液>注射去甲肾上腺素后蛙皮分泌液>灭活菌诱导后的血清>蛙皮浸提液,最小抑菌数量级的范围为32~128μg/mL。实验第二步以抑菌活性最强的电击后蛙皮分泌液为样品,经Sephadex G-50凝胶过滤初步分离后,采用C18制备型反相高效液相色谱柱分离,使用线性梯度洗脱方法,对照RP-HPLC图谱,按每峰一管收集洗脱液,冷冻干燥。接着用纸片法测定每管冻干粉的抑菌活性,并用分析型反相高效液相色谱经C18柱对抑菌活性最强的冻干粉进行纯度测定,Tricine-SDS-PAGE检测其分子量。结果表明;分离纯化后的冻干粉中蛋白类分子含量比较纯,其分子量约为3800Da。命名为抗菌肽GUEⅠ。实验第三步,使用蛋白质测序仪对抗菌肽GUEⅠ测序,结果表明;抗菌肽GUEⅠ由34个氨基酸残基构成,序列为FWFLDILNKTLGKIVNLFAGHLIKCTKVLTCPLP,理论分子量为3858.789Da。将测出的序列输入抗菌肽数据库(http;//aps.unmc.edu/AP/main.php)进行序列比对分析,发现与抗菌肽RANATUERIN 3的序列相似性是57.89%,与抗菌肽RANATUERIN 2的序列相似性是45.94%,并对抗菌肽GUEⅠ使用ANTHEPROT 5.0软件进行了二维空间结构预测。采用二倍稀释法测定对7种常见菌的抑制作用,发现抗菌肽GUEⅠ对4种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌的MIC处于8~16μg/mL之间,但对酵母菌的抑制作用不强。通过以上分析,推断抗菌肽GUEⅠ是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中分离纯化的抗菌肽,本研究为蛙类抗菌肽的理论研究和生产奠定了一定基础。
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摘要Abstract第1章 绪论1.1 沼泽绿牛蛙生物学概况及两栖类动物皮肤结构1.1.1 沼泽绿牛蛙生物学概况1.1.2 两栖类动物皮肤结构及活性物质1.1.2.1 两栖类动物皮肤结构1.1.2.2 两栖类动物皮肤活性物质1.2 两栖类动物抗菌肽概述1.2.1 两栖类动物抗菌肽种类1.2.2 两栖类动物抗菌肽的理化特性1.2.3 两栖类动物抗菌肽的生物活性1.2.4 抗菌肽作用机制1.2.4.1 抗菌肽对细菌的作用机制1.2.4.2 抗菌肽对真菌的作用机制1.2.4.3 抗菌肽对病毒的作用机制1.2.4.4 抗菌肽对肿瘤细胞、原虫的作用机制1.3 两栖类皮肤活性抗菌肽的研究现状1.3.1 国外研究现状1.3.2 国内研究现状1.4 抗菌肽的应用前景1.4.1 用于开发新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物1.4.2 应用在转基因工程中1.4.3 应用于新型绿色饲料添加剂中1.5 立题依据第2章 不同诱导方式得到沼泽绿牛蛙产物的抗菌活性比较2.1 实验材料2.2 实验设备2.3 实验方法2.3.1 样品收集2.3.1.1 蛙皮分泌液的收集2.3.1.2 蛙皮粗提取液的收集2.3.1.3 蛙血清中抗菌物质的诱导与收集2.3.2 检测抑菌活性2.4 结果2.5 讨论2.5.1 不同诱导方式的选择依据2.5.2 不同诱导方式的抑菌结果2.5.2.1 四种样品对细菌抑菌结果2.5.2.2 四种样品对酵母菌抑菌结果2.5.2.3 四种样品抑菌结果的比较第3章 蛙皮分泌液的分离纯化3.1 实验材料3.2 实验设备3.3 实验方法3.3.1 凝胶过滤层析分离3.3.1.1 Sephadex G-50凝胶过滤3.3.1.2 抑菌活性测定3.3.1.3 凝胶过滤层析脱盐3.3.2 制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离3.3.3 各峰收集液抑菌实验3.3.4 纯度鉴定3.3.4.1 分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测3.3.4.2 组分分析3.3.4.3 Tricine-SDS-PAGE检测3.4 结果与分析3.4.1 凝胶层析分离3.4.2 抑菌活性测定3.4.3 制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离3.4.4 分离后各峰收集液的抑菌作用3.4.5 纯度测定3.4.5.1 分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测3.4.5.2 组分分析3.4.5.3 Tricine-SDS-PAGE检测3.5 讨论3.5.1 凝胶过滤层析分离参数分析3.5.2 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离分析3.5.3 纯度鉴定第4章 测序分析与性质表征4.1 实验材料及设备4.2.1 测序4.2.2 序列与结构分析4.2.3 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的最低抑制浓度(MIC)测定4.2.4 温度和时间对抗菌活性的影响4.2.5 胰蛋白酶对抗菌活性的影响4.2.6 溶血及血液凝固活性测定4.3 结果4.3.1 抗菌肽GUE Ⅰ测序结果4.3.2 序列与结构分析4.3.3 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的最低抑制浓度(MIC)4.3.4 温度和时间对抗菌活性的影响4.3.5 胰蛋白酶对抗菌活性的影响4.3.6 溶血及血液凝固活性测定4.4 讨论4.4.1 抗菌肽GUE Ⅰ的序列与结构分析4.4.2 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的MIC4.4.3 抗菌肽与抗生素作用机制的比较4.4.4 理化因子对抗菌活性成分的影响4.4.5 溶血活性第5章 结论致谢参考文献攻读学位期间的研究成果
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