沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

论文摘要

本研究以沼泽绿牛蛙为实验材料,第一步对沼泽绿牛蛙的4种不同诱导方式所产生的4种产物进行了抗菌活性实验,结果表明4种诱导产物对金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌有一定的抑菌活性,但对酵母菌抑菌活性不明显。其抑菌活性由强到弱依次是电击后蛙皮分泌液>注射去甲肾上腺素后蛙皮分泌液>灭活菌诱导后的血清>蛙皮浸提液,最小抑菌数量级的范围为32~128μg/mL。实验第二步以抑菌活性最强的电击后蛙皮分泌液为样品,经Sephadex G-50凝胶过滤初步分离后,采用C18制备型反相高效液相色谱柱分离,使用线性梯度洗脱方法,对照RP-HPLC图谱,按每峰一管收集洗脱液,冷冻干燥。接着用纸片法测定每管冻干粉的抑菌活性,并用分析型反相高效液相色谱经C18柱对抑菌活性最强的冻干粉进行纯度测定,Tricine-SDS-PAGE检测其分子量。结果表明;分离纯化后的冻干粉中蛋白类分子含量比较纯,其分子量约为3800Da。命名为抗菌肽GUEⅠ。实验第三步,使用蛋白质测序仪对抗菌肽GUEⅠ测序,结果表明;抗菌肽GUEⅠ由34个氨基酸残基构成,序列为FWFLDILNKTLGKIVNLFAGHLIKCTKVLTCPLP,理论分子量为3858.789Da。将测出的序列输入抗菌肽数据库(http;//aps.unmc.edu/AP/main.php)进行序列比对分析,发现与抗菌肽RANATUERIN 3的序列相似性是57.89%,与抗菌肽RANATUERIN 2的序列相似性是45.94%,并对抗菌肽GUEⅠ使用ANTHEPROT 5.0软件进行了二维空间结构预测。采用二倍稀释法测定对7种常见菌的抑制作用,发现抗菌肽GUEⅠ对4种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌的MIC处于8~16μg/mL之间,但对酵母菌的抑制作用不强。通过以上分析,推断抗菌肽GUEⅠ是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中分离纯化的抗菌肽,本研究为蛙类抗菌肽的理论研究和生产奠定了一定基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 沼泽绿牛蛙生物学概况及两栖类动物皮肤结构
  • 1.1.1 沼泽绿牛蛙生物学概况
  • 1.1.2 两栖类动物皮肤结构及活性物质
  • 1.1.2.1 两栖类动物皮肤结构
  • 1.1.2.2 两栖类动物皮肤活性物质
  • 1.2 两栖类动物抗菌肽概述
  • 1.2.1 两栖类动物抗菌肽种类
  • 1.2.2 两栖类动物抗菌肽的理化特性
  • 1.2.3 两栖类动物抗菌肽的生物活性
  • 1.2.4 抗菌肽作用机制
  • 1.2.4.1 抗菌肽对细菌的作用机制
  • 1.2.4.2 抗菌肽对真菌的作用机制
  • 1.2.4.3 抗菌肽对病毒的作用机制
  • 1.2.4.4 抗菌肽对肿瘤细胞、原虫的作用机制
  • 1.3 两栖类皮肤活性抗菌肽的研究现状
  • 1.3.1 国外研究现状
  • 1.3.2 国内研究现状
  • 1.4 抗菌肽的应用前景
  • 1.4.1 用于开发新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物
  • 1.4.2 应用在转基因工程中
  • 1.4.3 应用于新型绿色饲料添加剂中
  • 1.5 立题依据
  • 第2章 不同诱导方式得到沼泽绿牛蛙产物的抗菌活性比较
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 实验设备
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 样品收集
  • 2.3.1.1 蛙皮分泌液的收集
  • 2.3.1.2 蛙皮粗提取液的收集
  • 2.3.1.3 蛙血清中抗菌物质的诱导与收集
  • 2.3.2 检测抑菌活性
  • 2.4 结果
  • 2.5 讨论
  • 2.5.1 不同诱导方式的选择依据
  • 2.5.2 不同诱导方式的抑菌结果
  • 2.5.2.1 四种样品对细菌抑菌结果
  • 2.5.2.2 四种样品对酵母菌抑菌结果
  • 2.5.2.3 四种样品抑菌结果的比较
  • 第3章 蛙皮分泌液的分离纯化
  • 3.1 实验材料
  • 3.2 实验设备
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 凝胶过滤层析分离
  • 3.3.1.1 Sephadex G-50凝胶过滤
  • 3.3.1.2 抑菌活性测定
  • 3.3.1.3 凝胶过滤层析脱盐
  • 3.3.2 制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离
  • 3.3.3 各峰收集液抑菌实验
  • 3.3.4 纯度鉴定
  • 3.3.4.1 分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测
  • 3.3.4.2 组分分析
  • 3.3.4.3 Tricine-SDS-PAGE检测
  • 3.4 结果与分析
  • 3.4.1 凝胶层析分离
  • 3.4.2 抑菌活性测定
  • 3.4.3 制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离
  • 3.4.4 分离后各峰收集液的抑菌作用
  • 3.4.5 纯度测定
  • 3.4.5.1 分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测
  • 3.4.5.2 组分分析
  • 3.4.5.3 Tricine-SDS-PAGE检测
  • 3.5 讨论
  • 3.5.1 凝胶过滤层析分离参数分析
  • 3.5.2 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离分析
  • 3.5.3 纯度鉴定
  • 第4章 测序分析与性质表征
  • 4.1 实验材料及设备
  • 4.2.1 测序
  • 4.2.2 序列与结构分析
  • 4.2.3 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的最低抑制浓度(MIC)测定
  • 4.2.4 温度和时间对抗菌活性的影响
  • 4.2.5 胰蛋白酶对抗菌活性的影响
  • 4.2.6 溶血及血液凝固活性测定
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 抗菌肽GUE Ⅰ测序结果
  • 4.3.2 序列与结构分析
  • 4.3.3 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的最低抑制浓度(MIC)
  • 4.3.4 温度和时间对抗菌活性的影响
  • 4.3.5 胰蛋白酶对抗菌活性的影响
  • 4.3.6 溶血及血液凝固活性测定
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 抗菌肽GUE Ⅰ的序列与结构分析
  • 4.4.2 抗菌肽GUE Ⅰ对七种菌的MIC
  • 4.4.3 抗菌肽与抗生素作用机制的比较
  • 4.4.4 理化因子对抗菌活性成分的影响
  • 4.4.5 溶血活性
  • 第5章 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间的研究成果
  • 相关论文文献

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