论文摘要
目前,生物法拆分消旋化合物的应用日益广泛,微生物酶法拆分2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮（以下简称γ-内酰胺）具有良好的应用前景。本实验室筛选得到的具有立体选择性拆分消旋γ-内酰胺的能力菌株L29-9细胞内含有可以分别作用于（+）γ-内酰胺和（-）γ-内酰胺的内酰胺酶。本实验对作用于（-）γ内酰胺的（-）γ内酰胺酶进行分离、纯化,并对其酶学性质进行了研究。细胞发酵上清液对γ-内酰胺无水解作用。手性HPLC分析表明超声破碎细胞后得到的粗酶液对消旋γ-内酰胺具有选择性水解作用。目的蛋白于55%-65%的硫酸铵饱和度区间被沉淀下来。此粗蛋白通过FPLC系统,依次经过疏水色谱phenyl-sepharose,离子交换色谱DEAE-sepharose及凝胶层析sephacryl分离后,经SDS-PAGE检测,目的蛋白分子量约为31kDa。本实验中目的蛋白的纯化倍数为3.3,纯化后（-）γ-内酰胺酶的活力可达61.3U/mg,酶的转化率和转化产物的光学纯度分别为64.8%和93.1%。初步的酶学性质研究表明,米氏常数Km=2.262X10-3mol/L;酶的最适温度为30℃,在60℃水浴15分钟后,酶活力下降到原来的11.7%,ee值下降为2.3%；该酶的最适pH为8.0,在pH7.0-8.5的范围内均可保持较高的酶活；EDTA对该酶的活力无明显影响,Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等离子对活力亦无明显影响。对酶的氨基酸N端序列进行了测定,将测序结果（GCITVGNENS）和与蛋白数据库进行比对,未发现此蛋白与其他蛋白有序列同源性。
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学位论文数据集摘要ABSTRACT第一章 文献综述1.1 手性化合物与生物不对称合成1.1.1 引言1.1.2 生命中的手性化合物1.1.3 手性药物及手性中间体的合成1.1.3.1 化学拆分法1.1.3.2 不对称合成1.1.3.3 微生物或酶催化拆分1.1.4 生物不对称合成与转化的应用与展望1.2 γ-内酰胺的酶法拆分1.2.1 γ-内酰胺简介1.2.2 拆分γ-内酰胺的研究进展1.2.2.1 色谱分离法1.2.2.2 微生物酶法1.3 酰胺酶及（-）γ-内酰胺酶的分离纯化1.4 课题的目的和意义第二章 （-）γ-内酰胺酶的分离纯化2.1 引言2.2 材料与方法2.2.1 主要试剂、药品和材料2.2.2 主要仪器2.2.3 实验方法2.2.3.1 菌种培养2.2.3.2 确定分光光度法测定酶的活力的条件2.2.3.3 HPLC确定各个步骤酶活力和ee值2.2.3.4 底物在不同pH下的自发水解作用2.2.3.5 目的蛋白在细胞内的定位以及破碎条件的选择2.2.3.6 硫酸铵沉淀条件的选择2.2.3.7 透析2.2.3.8 确定phenyl-sepharose的最佳分离条件2.2.3.9 确定DEAE-sepharose的最佳分离条件2.2.3.10 确定凝胶层析sephacryl S 200的分离条件2.2.3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.3.12 酶比活力和纯化倍数的确定2.3 结果与讨论2.3.1 酶活力和转化产物的光学纯度的测定方法2.3.2 底物无自发水解作用2.3.3 细胞破碎条件2.3.4 硫酸铵沉淀条件2.3.5 透析2.3.6 phenyl-sepharose的最佳分离条件2.3.7 DEAE-sepharose的最佳分离条件2.3.8 分子筛sephacryl S 200的分离条件2.3.9 SDS-PAGE2.3.10 蛋白纯化结果第三章 蛋白测序和酶学性质的研究3.1 引言3.2 材料与方法3.2.1 主要实验材料3.2.2 主要仪器3.2.3 实验方法3.2.3.1 测定酶的最适pH3.2.3.2 测定酶的最适温度和最耐温度3.2.3.3 测定金属离子对酶活力和转化产物的光学纯度的影响3.2.3.4 测定酶促反应的米氏常数Km3.2.3.5 目的蛋白活性染色3.2.3.6 胶内酶切及质谱测序3.2.3.7 Western-blot及氨基酸N-端测序3.3 结果与讨论3.3.1 酶的最适pH3.3.2 酶的最适温度和最耐温度3.3.3 金属离子对酶活力和转化产物的光学纯度的影响3.3.4 酶促反应的K3.3.5 目的蛋白活性染色结果3.3.6 质谱测序结果3.3.7 氨基酸N-端测序结果第四章 结论参考文献附录1附录2致谢研究成果及发表的学术论文作者及导师简介附件
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