论文摘要
恶性黑素瘤起源于黑素细胞,是皮肤癌中侵袭性最强的类型。它最突出的特点是对放、化疗的不敏感性以及外部刺激可以促进肿瘤的进展和转移。在美国,每年将近有40000恶性黑色素瘤的新发病人,在世界范围内估计约有100000病人发病。对于已经发生转移的恶黑仍然没有满意的治疗方法,评价的五年生存率约6%,因此恶性黑色素瘤引起了各国学者的关注,人们一直在期待着可以征服恶性黑色素瘤的新的疗法的出现。钙粘蛋白家族是粘附分子中的一个超家族,它们介导钙依赖的细胞间的粘附,在维持实体组织的形成及对生长发育过程中细胞选择性的相互聚集、重排中起重要作用,且钙粘蛋白的改变与肿瘤的发生及肿瘤细胞的浸润和转移有关。最近大量的数据表明恶性肿瘤的发生与T-cadherin表达的变化相关。T-cadherin的表达减少已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性B细胞淋巴瘤、皮肤鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌、结直肠癌和腺瘤等中检测到。T-cadherin这个新型钙粘蛋白分子在人类许多癌细胞中表达降低表明它或许在肿瘤细胞的侵袭和转移及维持正常细胞的表型中起重要作用。T-cadherin对人类癌症发生的影响变得越来越易于理解。然而,很少有研究直接证实T-cadherin这种新发现的无尾的钙粘蛋白确实是一种肿瘤抑制物这种假设,尚没有发表的研究阐明T-cadherin是如何抑制细胞间是如何转化的这个问题。Zhong等的研究报道了外源性T-cadherin的表达对CHO（中国仓鼠卵巢细胞）的生长、形态、促克隆形成及肿瘤发生的影响。T-cadherin的表达导致多细胞间紧密的粘附、聚集,减少了细胞的增值;而且T-cadherin在CHO中的表达导致了裸鼠皮下肿瘤生长的完全抑制。另外,Lee等研究发现T-cadherin在人类乳腺癌细胞系和乳腺癌标本中表达显著下调。在实验中Lee用连有T-cadherin的载体转染人乳腺癌细胞,结果表明T-cadherin的转染对肿瘤细胞的生长产生了明显的抑制作用,并且修正肿瘤细胞的表型,这些研究结果提示T-cadherin或许能为乳腺癌提供一种可能的矫正基因治疗的靶点。目前对于T-cadherin在恶性黑素瘤组织中的表达情况及T-cadherin在黑素瘤的发生过程中是否有作用则未见报道。为此,本研究使用免疫组化方法检测了恶性黑素瘤组织及黑素瘤细胞系中T-cadherin的表达情况,结果表明T-cadherin在人恶性黑素瘤组织中表达显著减少或缺失。并克隆了人T-cadherin基因,构建其真核表达载体并成功的转入真核细胞中。本研究的实验内容主要包括三部分:第一部分:正常表皮色素痣组织组织、黑色素瘤组织中T-cadherin的表达目的研究正常表皮色素痣组织和恶性黑素瘤组织中T-cadherin的表达是否有差异。方法收集门诊及住院病人正常表皮色素痣组织标本32份（20份冰冻标本,12份石蜡标本）、恶性黑素瘤组织标本14份（8份冰冻标本,6份石蜡标本）、黑素瘤细胞系M14和A375,使用SP免疫组化方法检测正常色素痣组织、恶性黑素瘤组织和黑素瘤细胞系中T-cadherin的表达情况。结果一光镜下可见正常表皮表皮各层结构清晰。色素痣为皮内痣、交界痣或复合痣,真皮上部可见痣细胞巢或束,痣细胞呈立方形,排列成巢,并可见多核痣细胞含有黑素,形态排列规则。黑素瘤组织HE染色镜下可见,异性瘤细胞自表皮向下侵入真皮,瘤细胞形态大小有很大差异,核分裂常见。瘤细胞有上皮样细胞形和梭细胞形,肿瘤细胞内有许多黑素。二正常皮肤组织及色素痣冰冻及石蜡切片的HMB-45和T-cadherin免疫组化染色。在正常皮肤组织及色素痣冰冻组织块中见到T-cadherin表达在正常皮肤表皮的基底细胞层;另外,在毛发毛囊的外鞘及毛囊峡部和漏斗部的角化细胞和皮脂腺、汗腺、立毛肌,血管内皮、正常黑素细胞均可见T-cadherin表达。外分泌腺的基底细胞也有T-cadherin的表达见;而HMB-45表达均为阴性。三黑素瘤组织冰冻及石蜡切片的T-cadherin和HMB-45免疫组化染色。用SP法DAB和AEC显色对14份黑素瘤患者的的冰冻及石蜡组织切片进行了T-cadherin和HMB-45的染色,结果见黑素瘤实体瘤组织细胞T-cadherin的表达表达缺失,间质可见T-cadherin的少量表达;而瘤组织细胞的HMB-45染色呈强阳性。四黑素瘤细胞爬片的免疫组化染色。用SP法DAB和AEC显色对M14、A375黑素瘤细胞爬片进行T-cadherin的染色,结果见黑素瘤细胞系M14、A375均弱表达T-cadherin。结论T-cadherin作为粘附分子家族中特殊的一员,其在恶性黑素瘤组织、细胞的表达与正常正常皮肤和色素痣组织相比比明显降低或缺失,提示T-cadherin在皮肤恶性黑素瘤的发生、发展和转移中可能起重要作用。第二部分:人T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建目的从人子宫平滑肌组织中克隆T-cadherin基因,并构建真核表达载体pEGFP-N1/T-cadherin。方法1 T-cadherin cDNA的克隆:取手术切下的人正常子宫平滑肌组织,Trizol一步法提取总RNA。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳证实所提RNA没有明显降解后,SuperscriptⅢ逆转录酶作用下进行逆转录反应,PfxDNA聚合酶作用下进行聚合反应得到目的片断。2 T-cadherin真核表达载体的构建:提取质粒pEGFP-N1,将pEGFP-N1及T-cadherin cDNA分别用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,电泳分离,用纯化回收试剂盒进行回收T-cadherin cDNA片断和线性质粒pEGFP-N1,T4DNA连接酶连接两片断,连接产物转化感受态菌Top10,小量提取质粒,限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切鉴定后中量提取质粒,送上海生物工程技术公司测序。结果1总RNA提取情况,以TRIzol一步法提取人子宫平滑肌组织的总RNA,通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察RNA的带形来估计mRNA的完整性。本实验中琼脂糖凝胶的浓度为1%。清楚看到28s、18s和5s RNA带形。说明RNA没有明显降解,可用来反转录合成cDNA。2 T-cadherin-cDNA片断扩增产物的的获得,用上下游引物,以从子宫平滑肌组织中提取的总RNA反转录出的cDNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到预期的cDNA片断,进行34个循环的PCR扩增,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈明显条带,其大小为2000～2200bp。3 PCR产物的克隆及cDNA序列的测定,回收并纯化PCR产物后,将其克隆于pEGFP-N1真核表达载体,分别用引物两端的EcoR I和BamH I进行酶切鉴定,将有2000～2200bp片断插入的克隆送检测序,结果证实插入片断为T-cadherin-cDNA,其序列与GeneBank（NM001257）报道的完全一致,据测序报告分析,载体内插入了正确的片断。4质粒pEGFP-N1和T-cadherin经限制性内切酶EcoR I和BamH I消化,分离纯化分别得到4.68kb和2.142kb的片断,将回收的两线性DNA片断进行连接重组、转化、小量提取、限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切电泳后,证明重组质粒有T-cadherin基因插入,说明pEGFP-N1/T-cadherin载体构建成功。结论本研究从人子宫平滑肌组织中成功提取出总RNA。通过RT-PCR方法克隆了编码序列完全正确的人T-cadherincDNA。将T-cadherin基因克隆到了真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了真核表达载体pEGFP-N1/T-cadherin。第三部分: T-cadherin基因转染人黑素瘤细胞目的检测所克隆的T-cadherin基因能否正确表达。方法脂质体LipofectamineTM2000转染人M14和A375细胞:当两种细胞融合度达90%时,将真核表达载体pEGFP-N1/T-cadherin-LipofectamineTM2000复合物加入其中,通过pEGFP-N1载体携带的绿色荧光蛋白或G418筛选。结果在转染24小时后放入荧光显微镜下观察,可见pEGFP-N1和pEGFP-N1/T-cadherin转染成功的细胞分别发出绿色荧光（pEGFP-N1的激发/发射波（excitation/emission）=488/507）。而pBudCE4.1（激发/发射波（excitation/emission）=575/630nm）的激发波不在本室显微镜的激发波长范围（510～560 nm）内,故未能观察到相应的红色的荧光。空载体的转染效率达70～80% ,连有目的基因的载体转染效率略低。结论重组质粒pEGFP-N1/T-cadherin转染M14和A375细胞成功。