葡萄细胞培养生产花青素不稳定性研究

论文摘要

植物细胞培养生产次生代谢物的不稳定性是工业化瓶颈之一。本论文以葡萄（Vitis vinifera）细胞为模式体系,研究了花青素合成的各种不稳定现象,考察了影响不稳定性的因素,以改善细胞系均一性为基础,实现了葡萄细胞培养花青素的相对稳定生产。通过对葡萄细胞生长和代谢的考察,确认了基本培养条件,优化到了花青素高产培养工艺。葡萄细胞培养过程中花青素的合成表现出4种不稳定性现象: （1）在长期培养过程中,花青素合成能力呈下降的趋势,变异系数为54-84 %; （2）花青素合成能力存在着非规律的周期性振荡; （3）同一批次培养的重复摇瓶实验表现出不稳定性,变异系数为4-17 %; （4）花青素组成具有不稳定性。培养体系的不均一性是造成不稳定性的直接原因。接种量比继代周期对不稳定性的影响更大,7 d继代周期和1.60 g接种量的继代条件下花青素合成相对稳定;光照对花青素的稳定生产不利。采用色差筛选法得到了相对均一的E悬浮系,其继代过程中花青素合成的变异系数仅为8.7 %。以E为实验材料,严格控制7 d继代周期和1.60 g接种量的继代条件,于黑暗条件下培养,并使用5 mg/L Phe和218μM MeJA联合诱导,可使花青素产量的变异系数均控制在3 %以内;且花青素产量是对照组的4.3倍,初步实现了葡萄细胞花青素的相对稳定高产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物次生代谢与次生代谢产物
• 1.1.1 植物初生代谢与次生代谢
• 1.1.2 次生代谢产物的主要类型
• 1.1.3 植物次生代谢产物合成的主要途径
• 1.2 植物细胞培养生产次生代谢产物
• 1.2.1 植物细胞培养的优势
• 1.2.2 提高次生代谢物产量的方法
• 1.2.3 植物细胞培养反应器及其工业化现状
• 1.2.3.1 植物细胞培养反应器类型
• 1.2.3.2 植物细胞培养操作方式
• 1.2.3.3 植物细胞培养工业化现状
• 1.3 植物细胞培养生产次生代谢产物的不稳定性
• 1.3.1 不稳定性现象
• 1.3.2 不稳定性研究现状
• 1.4 葡萄细胞培养研究现状
• 1.4.1 葡萄细胞培养做不稳定研究模式体系的依据
• 1.4.2 葡萄细胞培养研究现状
• 1.5 本课题研究目的及论文工作设想
• 参考文献
• 第二章 葡萄细胞培养基本条件考察
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 细胞株的来源及继代培养
• 2.2.3 生物量及次生代谢产物的测定
• 2.2.3.1 生物量的测定
• 2.2.3.1.1 鲜重法
• 2.2.3.1.2 干重法
• 2.2.3.2 花青素的提取和测定
• 2.2.3.2.1 花青素的提取
• 2.2.3.2.2 分光光度计法测定总花青素含量
• 2.2.4 培养条件的优化
• 2.2.5 前体饲喂和诱导子的作用
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 培养条件的优化
• 2.3.1.1 基础培养基和激素对花青素合成的影响
• 2.3.1.2 光照对花青素合成的影响
• 2.3.2 前体饲喂和诱导子添加对花青素合成的影响
• 2.3.3 不同产量细胞株对前体和诱导子的响应
• 2.3.4 联合作用对花青素合成的影响
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 葡萄细胞培养次生代谢不稳定性及其与初生代谢的关系
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 次生代谢不稳定性
• 3.2.2.1 实验细胞株
• 3.2.2.2 继代不稳定性实验设计
• 3.2.2.3 重复摇瓶不稳定性实验设计
• 3.2.3 初生代谢与次生代谢的关系
• 3.2.3.1 胞内C 的测定
• 3.2.3.1.1 胞内可溶性糖的提取
• 3.2.3.1.2 蔗糖测定
• 3.2.3.1.3 果糖测定
• 3.2.3.1.4 葡萄糖测定
• 3.2.3.2 胞内N 的测定
• 3.2.3.2.1 胞内可溶性蛋白提取
• 3.2.3.2.2 Bradford 法测定蛋白
• 3.2.3.3 胞内P 的测定
• 3.2.3.3.1 胞内总磷提取
• 3.2.3.3.2 磷钼蓝法测总磷
• 3.2.3.4 生物量及花青素的测定
• 3.2.3.5 实验设计
• 3.2.4 数据处理
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 次生代谢不稳定性
• 3.3.1.1 继代培养的不稳定性
• 3.3.1.2 重复摇瓶培养的不稳定性
• 3.3.2 初生代谢与次生代谢的关系
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 继代条件与次生代谢不稳定性的关系
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验细胞株
• 4.2.3 继代周期对次生代谢不稳定性影响的实验设计
• 4.2.4 接种量对次生代谢不稳定性影响的实验设计
• 4.2.5 分析方法
• 4.2.6 数据处理
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同继代条件对葡萄细胞花青素合成的影响
• 4.3.2 葡萄细胞花青素各组分合成的不稳定性
• 4.3.2.1 HPLC 分离花青素
• 4.3.2.2 HPLC 与分光光度法测量花青素比较
• 4.3.2.3 HPLC 考察花青素各组分合成的不稳定性
• 4.3.3 因子分析法考察继代条件对花青素合成不稳定性的影响
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 改善不稳定性的探索
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 实验细胞株
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 细胞株筛选
• 5.2.3.2 悬浮筛选过程的稳定性考察
• 5.2.3.3 联合诱导的继代稳定性
• 5.2.3.4 重复摇瓶培养稳定性
• 5.2.4 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 悬浮筛选过程稳定性
• 5.3.2 联合诱导的继代稳定性
• 5.3.3 重复摇瓶培养稳定性
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 附录
• 作者简介
• 博士研究生期间撰写及发表文章如下
• 致谢