鲢补体C7和白细胞介素-1β基因的克隆、表达及序列分析

论文摘要

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是我国最重要的淡水养殖品种之一，但是鲢在养殖过程病害频发，尤以败血症为甚，病原体主要是嗜水气单胞（Aeromonas hydrophilia），由它引起的疾病一般病势较猛，多为恶性传染病，死亡率很高。本研究克隆了鲢的补体C7基因和白细胞介素-1基因，分析它们在不同组织中的表达以及鱼体受到病原入侵后的反应，有助了解鲢抗病机理、也为鲢抗病育种提供科学依据。补体C7是补体系统的重要成分，是将补体系统活化形成末端补体复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。白细胞介素-1在介导炎症反应和增强免疫反应中具有重要的作用。本研究对鲢（Hypophthalmichthys molitrix）补体C7和白细胞介素-1基因分别进行了克隆、表达和序列分析，主要研究结果如下：（1）鲢补体C7的克隆与分析：从鲢cDNA文库中克隆补体C7的cDNA，其全长2625bp，编码821个氨基酸。同源性分析表明，鲢补体C7与斑马鱼的氨基酸序列相同率最高（为82%）。与已报道的硬骨鱼类补体C7相同，鲢补体C7具有一些保守的结构，如TSP1、LDLRa、MACPF、EGF、TSP1、CCP。对12尾鲢补体C7进行遗传多样性分析发现有6个突变位点，其中5个是同义突变，另外一个是非同义突变，确定6个等位基因。在鲢正常组织和嗜水气单胞菌感染的免疫器官组织中，对C7基因进行了RT-PCR表达分析，结果显示，正常状态下，鲢补体C7基因只在脾脏中表达，在感染嗜水气单胞菌12小时后，鲢C7基因在脑、鳃、心脏、肾脏、肝脏、肠、脾脏7种组织中迅速表达，随着病原的清除，补体C7基因表达量也逐渐降低直至停止表达。（2）鲢白细胞介素-1β的克隆与分析：使用简并引物扩增得到白细胞介素-1β的一个保守片段，使用RACE扩增获得白细胞介素-1β cDNA，其全长1534bp，含完整编码区，其编码区长825bp，编码275个氨基酸。此外，鲢IL-1β cDNA5’非编码区有357bp，3’非编码区有351bp,3’UTR含有3个不稳定模体（ATTTA）。同源性分析表明，鲢IL-1β与草鱼的氨基酸序列相同率最高（为77%）。鲢IL-1β含有IL-1家族经典蛋白信号：[FCL]-x-S-[ASLV]-x（2）-[PSK]-x（2）-[FYLIV]-[LI]-[SCA]-T-x（7）-[LIVM]，并含有5个N-糖基化位点。RT-PCR分析显示，正常状态下，鲢IL-1β基因只在脾脏中表达，在感染嗜水气单胞菌12小时后，鲢IL-1β基因在脑、鳃、心脏、肾脏、肝脏、肠、脾脏7种组织中迅速表达，随着病原的清除，IL-1β基因表达量也逐渐降低直至停止表达。对鲢补体C7和白细胞介素-1β在不同组织中的表达的研究表明，这两个基因都是与嗜水气单胞菌感染相关的基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 补体系统
• 1.1.1 补体系统的概述
• 1.1.2 补体的生物学功能
• 1.1.3 补体系统的特点
• 1.1.4 补体的介导途径
• 1.1.5 鱼类补体的特点
• 1.1.6 补体系统的活化
• 1.1.7 补体系统的生物合成
• 1.1.8 补体系统的研究现状
• 1.2 细胞因子的研究情况
• 1.2.1 细胞因子简介
• 1.2.2 白细胞介素
• 1.2.3 白细胞介素-1 的研究简介
• 1.2.4 白细胞介素-1 的结构和特性
• 1.2.5 白细胞介素-1 的生物学特性
• 1.3 本论文研究意义
• 第2章 鲢补体 C7 基因的克隆、表达和序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验所用仪器
• 2.1.3 试剂盒和主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总 RNA 的提取
• 2.2.2 cDNA 模板的制备
• 2.2.3 cDNA 文库的筛选
• 2.2.4 鲢群体补体 C7 的扩增及测序
• 2.2.5 补体 C7 的组织表达
• 2.2.6 序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 鲢组织细胞总 RNA 的提取
• 2.3.2 鲢补体 C7 序列分析
• 2.3.3 鲢补体 C7 氨基酸序列分析
• 2.3.4 鲢补体 C7 序列遗传多样性的分析
• 2.3.5 鲢补体 C7 组织特异表达分析
• 2.4 讨论
• 第3章 鲢 IL-1β基因的克隆、表达和序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 SMART cDNA 的合成
• 3.1.2 合成 SMART cDNA 第一链
• 3.1.3 5’RACE-PCR
• 3.1.4 3’RACE-PCR
• 3.1.5 鲢 IL-1β的组织表达
• 3.1.6 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 鲢 IL-1β序列特征
• 3.2.2 鲢 IL-1β氨基酸序列分析
• 3.2.3 鲢 IL-1β组织特异表达分析
• 3.3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录