大豆疫霉菌小RNA通路核心组件的识别分析及其突变体的筛选

论文摘要

卵菌（Oomycetes）是一类形态上与真菌类似,而进化上与藻类极为相近的真核类微生物,也是一类重要的动植物病原菌。其中疫霉属（Phytophthora）的大部分成员都是毁灭性的植物病原菌,在全球范围内造成巨大的经济损失。曾经导致爱尔兰大饥荒的致病疫霉菌（Phytophthora infestans）,至今仍然是马铃薯产业的最严重病害问题;大豆疫霉菌（Phytophthora sojae ）引起的大豆疫霉根腐病是大豆毁灭性病害之一。MicroRNA和siRNA等小分子非编码RNA是近年来发现的重要调控因子,在生物的生长发育和抗逆胁迫等生命活动过程中发挥重要的调节作用。迄今为止,在动物、植物、真菌和病毒中都已有相关小分子RNA的报道,而卵菌中却一直未见相应的报道。因此,识别卵菌小RNA通路中的核心蛋白及其特征,对于研究卵菌小RNA通路的存在情况以及小RNA的生物合成、功能和调控机制都具有重要意义,对全面开展卵菌类病原菌在生物学和病理学方面的研究极具推动作用。大豆疫霉菌是同宗配合,且具有高质量的基因组序列和大量已公布的EST数据,已成为卵菌中的模式种。我们以大豆疫霉菌为实验材料,通过BLAST确定了其DCL（Dicer-like protein）和RDR（RNA-dependent RNA polymerase）等小RNA通路中核心蛋白的同源物;通过Pfam分析表明大豆疫霉菌的DCL1蛋白具有2个RNase III结构域、1个双链RNA结合结构域和1个DEAD结构域,但缺失动植物Dicer/DCL蛋白的PAZ结构域和dsrm模体,因此我们推测卵菌基于DCL蛋白的小RNA产生机制可能与其他真核生物不同。而大豆疫霉菌RDR蛋白候选的确定,表明其具有RNA扩增的潜在机制。本实验室建立了大豆疫霉菌的EMS化学诱变突变体库,为筛选大豆疫霉中小RNA生物合成相关基因的突变体奠定了基础。本实验中主要采用TILLING技术筛选大豆疫霉小RNA通路关键基因的突变体。实验设计上我们对传统的TILLING技术进行了一些改进,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SYBR GREENⅠ染色的方法来检测异源双链经CJE（Celery Juice Extract）处理后的酶切条带,这种方法既简化了实验操作又降低了实验成本。而且经过实验摸索,我们已经初步建立了利用TILLING技术对大豆疫霉菌EMS突变体库的筛选条件,并且获得了PsDCL1基因的候选突变体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 卵菌的生物学特征及危害性
• 1.2 反向遗传学及TILLING 技术的发展和应用
• 1.2.1 疫霉菌的全基因组测序
• 1.2.2 反向遗传学方法
• 1.2.3 TILLING 技术的发展及应用
• 1.2.4 CELⅠ酶研究进展
• 1.3 小RNA 的生物合成及其功能研究
• 1.3.1 参与小RNA 生物合成的核心组件
• 1.3.2 小RNA 的生物合成
• 1.3.3 小RNA 的生物学功能
• 1.4 研究目的及意义
• 第二章 大豆疫霉菌DCL 和RDR 蛋白的识别分析及其突变体的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.2 TILLING 技术在大豆疫霉中的应用
• 2.3 大豆疫霉菌EMS 化学诱变突变体库简介
• 2.4 液氮超低温法保存突变体库及DNA 混合池的制备
• 2.4.1 液氮超低温法保存突变体库
• 2.4.2 突变体库DNA 混合池的制备
• 2.5 大豆疫霉菌DCL 和RDR 蛋白的识别分析及其突变体的筛选
• 2.5.1 大豆疫霉菌DCL 和RDR 蛋白的识别分析
• 2.5.2 引物设计
• 2.5.3 PCR 及异源双链的形成
• 2.5.4 阳性对照的选取
• 2.5.5 CELⅠ酶切割反应
• 2.5.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 大豆疫霉菌DCL 和RDR 蛋白的识别分析结果
• 3.2 大豆疫霉菌突变体库混合DNA 的提取
• 3.3 PsDCL 和PsRDR 基因的特异性扩增
• 3.4 CELⅠ酶切割阳性对照的检测结果
• 3.5 PsDCL 和PsRDR 基因的筛选结果
• 第四章 结论与创新点
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录1：培养基和试剂的配制
• 附录2：PsDCL1 基因全序列
• 附录3：PsRDR1 基因全序列
• 致谢
• 作者简介