石斛遗传多样性分析及其多糖提取工艺研究

论文摘要

石斛属（Dendrobium Sw.）是兰科（Orchidaceae）中第二大属,全世界约有1500种,主要分布在亚洲的热带,亚热带和北美洲。许多世纪以来石斛属植物被用作传统的药用植物。现代药理研究表明,石斛属植物有多种药理作用,如抗癌,抗氧化,免疫调节,与血管舒张功能的影响。然而多数石斛植物分布地域虽然广泛却生长在相对狭隘的小气候生境,具有较显著的生态多样性。由于其具有很高的药用价值和园艺观赏,目前在市场上进行大量交易,导致石斛属植物资源处于濒危状态,因此加快并深入对石斛的研究和保护工作是当务之急。分子标记技术能从DNA水平上反映物种的遗传差异,是研究遗传多样性的有效方法。ISSF分子标记技术具有简便、快速、稳定性好、无种属特异性等优点,广泛应用于遗传多样性研究。本研究以福建农林大学茶叶科技与经济研究所石斛的30个属命名种为研究对象,采用ISSR分子标记方法,对其遗传多样性以及亲缘关系进行研究。该研究不仅有利于今后的种质资源保护,还对杂交育种亲本的选择具有重要的指导作用。铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall. ex Lindl.）作为药用石斛之上品,是资源最为缺乏的一种。在进行铁皮石斛化学成分的研究中,发现其主要的药效成分为多糖,具有较高的开发价值。本研究采用响应曲面法对其提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行工艺优化,为今后石斛多糖的提取工艺提供依据和参考,并为石斛多糖的深入研究奠定基础。本研究主要结果如下：（1）采用单因素多水平法进行试验设计,对模板DNA、dNTP、100×PCR Buffer、引物、Taq DNA聚合酶这5个因素进行体系优化,建立了石斛的ISSR-PCR扩增体系,结果为：在20μL反应体系中,模板DNA （10 ng·uL-1） 3 μL, dNTP （2.5 mmol·L-1） 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物（4μmol·L-1） 3.5 μL, Taq DNA聚合酶（5U·μL-1） 0.2 μL, ddH2O8.8μL。（2）从20条ISSR引物中筛选出7条扩增清晰的引物,之后对30个石斛品种进行遗传多样性分析,共扩增52条清晰的条带,其中多态性条带30个,占总条带的57.7%,每个引物平均扩增出7.4个条带。（3）根据ISSR-PCR扩增结果,利用Ntsys软件计算出遗传相似系数,其范围在0.60～0.93。按UPGMA聚类法对30个石斛品种进行聚类分析,其结果将供试材料分为两大组,5号样品明显与其它29种石斛亲缘关系最远；1号样品和21号样品亲缘关系较近；3号样品和8号样品亲缘关系较近；10号样品和19号样品亲缘关系较近；26号样品和28号样品亲缘关系较近。（4）采用水提醇沉法,在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计方法,对提取温度、料液比、提取时间和提取次数4个因素的3个水平进行响应曲面分析,建立了影响铁皮石斛多糖提取的二次方程模型,方程为：Y=14.03+1.05A+1.25B+0.12C+0.76D-0.29AB+0.34AC-0.098AD+0.21BC-0.20BD+0.29CD-0.94A2-0.76B2-0.64C2-0.22D2。根据试验数据分析,得到各因素对铁皮石斛多糖提取影响顺序：料液比（B）>提取温度（A）>提取次数（D）>提取时间（C）。铁皮石斛多糖的最优提取工艺条件：提取温度85℃,料液比1：37,提取时间2.3 h,提取次数4次。在此工艺条件下,铁皮石斛多糖的提取率可达14.98%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 石斛的概括
• 1.1 石斛属资源概况及用途
• 1.2 石斛属化学成分的研究概况
• 1.2.1 石斛多糖
• 1.2.2 生物碱类化合物
• 1.2.3 氨基酸类化合物
• 1.2.4 微量元素
• 1.2.5 联苄类化合物
• 1.2.6 其它类化合物
• 1.3 药理作用研究
• 1.3.1 降血糖作用
• 1.3.2 抗肿瘤作用
• 1.3.3 抗氧化作用
• 1.3.4 抑菌作用
• 1.4 多糖的提取方法
• 1.4.1 水提醇沉法
• 1.4.2 碱提法
• 1.4.3 酶解提取法
• 1.4.4 超声波辅助提取法
• 1.4.5 微波辅助提取法
• 1.4.6 超临界流体萃取法
• 1.5 多糖含量测定方法
• 2 遗传多样性研究方法
• 2.1 形态学标记（Morphological marker）
• 2.2 生化标记（Biochemical marker）
• 2.3 细胞学标记（Cytological marker）
• 2.4 分子标记（Molecular marker）
• 2.4.1 RARD标记
• 2.4.2 SSR标记
• 2.4.3 ISSR标记
• 2.4.4 SRAP标记
• 2.4.5 EST标记
• 3 分子标记技术在石斛属植物中的应用
• 3.1 种植资源鉴定
• 3.2 亲缘关系与分类
• 3.3 遗传多样性分析
• 4 本研究的选题背景、意义、内容
• 4.1 研究的选题背景与意义
• 4.2 研究的内容
• 第二章 石斛遗传多样性分析
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 石斛叶片DNA的提取
• 1.5.2 ISSR-PCR扩增反应体系优化
• 1.5.3 引物筛选
• 1.5.4 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ISSR-PCR反应体系优化结果与分析
• 2.1.1 模板DNA优化
• 2.1.2 dNTP优化
• 2.1.3 10×PCR Buffer优化
• 2.1.4 引物优化
• 2.1.5 Taq DNA聚合酶优化
• 2.2 引物筛选结果与分析
• 2.3 遗传相似性聚类分析与亲缘关系分析
• 2.3.1 石斛属遗传相似性聚类分析
• 2.3.2 石斛属亲缘关系分析
• 3 小结与讨论
• 第三章 响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取工艺的研究
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 铁皮石斛多糖提取工艺流程
• 1.4.2 标准曲线的制作
• 1.4.3 铁皮石斛多糖含量的测定
• 1.4.4 多糖提取率计算方法
• 1.4.5 单因素提取试验
• 1.4.6 响应曲面试验
• 2 结果与分析
• 2.1 单因素提取试验结果与分析
• 2.1.1 提取温度对铁皮石斛多糖提取率的影响
• 2.1.2 料液比对铁皮石斛多糖提取率的影响
• 2.1.3 提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响
• 2.1.4 提取次数对铁皮石斛多糖提取率的影响
• 2.2 响应曲面试验结果与分析
• 2.2.1 响应曲面试验设计与结果
• 2.2.2 模拟方程与显著性检验
• 2.2.3 响应曲面分析
• 3 小结与讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢