论文摘要
系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种典型的可累及全身多器官系统的自身免疫性疾病,其主要的免疫学特征是自身反应性B淋巴细胞的多克隆活化增殖,机体产生大量自身抗体,并以循环免疫复合物的形式沉积于组织和器官,导致组织器官损害。其确切的病因和发病机制尚不十分清楚。自身抗体被认为在SLE的发病中起着重要的作用。目前临床上治疗SLE的主要措施仍是使用激素和非特异性免疫抑制剂,如糖皮质激素、环磷酰胺等。尽管这些药物能广泛地抑制免疫活性细胞,有效地控制疾病病程,但毒副作用明显。另外由于自身反应性淋巴细胞在用药后持续存在,难以达到治愈SLE的目的。由于血清中多克隆自身抗体的存在是SLE的基本病理特征,表明产生自身抗体的B细胞在系统性红斑狼疮发病机制中起着重要作用。因此,清除或抑制B细胞的功能是治疗SLE的新方向。近年来靶向B淋巴细胞治疗SLE取得了很大进展,然而由于浆细胞是致病性自身抗体的直接来源,仅仅针对可分裂的B细胞,不能清除自身抗体的根本来源,导致患者病情反复发作,无助于疾病的痊愈。可见仅仅针对B淋巴细胞治疗SLE难以避免疾病的复发。研究表明,CD20、 BAFF两种耗竭B细胞治疗SLE的方法中,在B细胞终末分化为浆细胞时消失,即CD20单抗和BAFF抑制剂不能清除浆细胞,而40%自身抗体分泌性浆细胞是长寿命的,长寿浆细胞产生的自身抗体可再次激活潜在的病理免疫应答反应。可见,要使SLE长期得以缓解,还需要抑制浆细胞（包括长寿浆细胞）及其功能,直接清除或减少自身抗体产生来源,使治疗SLE产生更为有效、持久的效果。所以寻求影响浆细胞存活及其功能的特异靶标是治疗’SLE的关键。转录因子Blimpl （B-lymphocyte-induced maturation proteinl）是具有5个锌指结构的98KD蛋白,是诱导成熟B淋巴细胞终末分化为浆细胞并分泌抗体的主调控子,是浆细胞形成和免疫球蛋白分泌所必需的转录因子,也是维持骨髓中长寿浆细胞所必需的转录因子,是维持长期抗原特异免疫反应所必需。目前Blimp1维持浆细胞存活及抗体分泌的机制尚不清楚,在LPS诱导小鼠原代B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中,Blimp1的表达显著增高,这可能同B淋巴细胞分化的调控密切相关。我们的前期研究采用RNA干扰技术抑制Blimp1的表达,发现浆细胞的表型细胞J558L中Blimp1受抑制后,其表面标记CD138表达下降,而原本不表达的B淋巴细胞免疫标记CD19开始出现。同时发现与维持浆细胞存活、免疫球蛋白（Ig）分泌功能相关的BCMA、XBP-1及J链表达下降,可见浆细胞中Blimpl被抑制后,浆细胞发育程序出现再编程,发生了去分化现象。这些研究提示,Blimp1是维持浆细胞存活及功能的关键因子,以Blimp1为靶标的抑制性分子将可能通过抑制抗体的产生,用于抗体所致免疫性疾病的治疗,从而有望用于SLE等自身免疫性疾病的治疗。B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen,BCMA）为B细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子受体家族（TNFR）,属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白,它可分别与B细胞激活因子BAFF或APRIL（a proliferation induced ligand）两种配体相结合。BAFF的其他两个受体TACI和BAFF-R在B淋巴细胞发育及自身免疫性疾病发病中的作用都有较系统的研究。BCMA主要在成熟B细胞、浆细胞表面表达,由184个氨基酸残基组成,其胞内区含80个氨基酸残基,胞外区序列很短,只有一个CRD。 BCMA在B细胞的作用机制尚未完全阐明。BCMA基因剔除小鼠免疫系统表现正常,有正常的脾结构,B淋巴细胞的发育正常,针对外来抗原的体液免疫TI和TD也未见明显异常,但浆细胞数量明显减少,证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用,其可能机制是BCMA与BAFF蛋白结合,并上调抗凋亡基因Bcl-2, Mcl-1及Bclw等,维持细胞生长。阻断BCMA可选择性地抑制浆细胞的存活,从而成为治疗SLE的潜在靶点。那么,既然Blimp1、 BCMA都为影响浆细胞存活的重要因子,它们之间有何联系,如何调控浆细胞存活及功能呢?哪一种可能是治疗SLE更有效的靶标?分析B细胞发育过程基因表达谱,发现Blimpl与BCMA都随着B细胞的发育成熟而出现,并且表达量都逐渐增加,且都只表达于成熟B淋巴细胞及浆细胞阶段,皆为维持浆细胞存活所必需,在B细胞发育的时空性上表现出惊人的一致。Blimp1调节的直接靶基因,被证实的有c-myc、 CIITA、 Pax-5、 Spi-B及Id3等,对Blimp1结合已知靶基因的核苷酸序列分析得知,Blimp1对己知靶基因的结合位点都有相似的序列,为"NNNNGAAAGNN"。分析BCMA基因的上游调控序列,发现两个可能的Blimp1结合序列,分别位于“-46--36”、“-31～-21”位。国内外对Blimp1与BCMA相互调控机制研究还很少,近期有研究表明Blimp1对BCMA基因具有激活作用,且剂量与活性正相关,在BCMA基因的转录调控中起重要作用。将BCMA基因5’上游“-46--36”、“-31--21”位序列两个可能的Blimp1结合位点,采用定点突变技术,进行相应的替代突变,结果发现"-38--42"位的‘’GAAAC"位点,影响Blimp1对BCMA启动子的识别,可能为Blimp1结合BCMA启动子的位点。Blimp1蛋白对BCMA启动子的调节作用可能与维持浆细胞的存活机制相关。基于以上原因,我们提出Blimp1可能通过与BCMA"-38--42"位的"GAAAC"位点结合,直接调控BCMA表达,并在维持浆细胞存活及抗体分泌中发挥主导作用。浆细胞的存活必需Blimp1、BCMA、XBP-1的持续表达,已证实XBP-1为Blimp1的下游分子,如BCMA也为Blimp1下游分子,则Blimp1处于主调控子的地位。抑制Blimp1能阻抑自身免疫中浆细胞功能,促进浆细胞凋亡,进而为开发治疗SLE等自身免疫性疾病的新药奠定基础。SLE是以多克隆B细胞活化,多种自身抗体大量产生为特征所致的抗体性疾病,Blimp1在浆细胞分化处于主调控了的地位。因此,阻断Blimp1的表达或活性,有可能影响长寿浆细胞的存活,减少抗体产生,降低抗原抗体导致的免疫反应从而达到治疗SLE的目的。目前Blimp1在SLE中1的作用研究尚未见相关报道。研究Blimp1基因在SLE中的表达并进一步研究其在SLE治疗中的作用,对于进一步从新的角度探索新的治疗方案具有重要意义。目的1、探讨Blimp1对BCMA的转录调控作用,明确维持浆细胞存活的两个重要因子Blimp1与BCMA间的关系,了解Blimp1、BCMA维持浆细胞存活及抗体分泌的作用机制。2、研究Blimpl在系统性红斑狼疮的表达情况,为开发靶向浆细胞治疗SLE等自身免疫性疾病的新药奠定基础。研究方法1. Blimp1对BCMA的调控：1)凝胶移动抑制分析实验（EMSA）采用具有浆细胞表型的小鼠骨髓瘤细胞J558L细胞,提取细胞核蛋白,设计5生物素标记的BCMA探针。双链探针与核蛋白提取物孵育,结合产物进行非变性PAGE电泳,化学发光显影,采用Blimpl抗体进行超移动抑制分析。2)染色质免疫沉淀分析（CHIP）1%甲醛处理结合在DNA上的转录因子交联,超声破碎,采用抗Blimpl抗体孵育,蛋白G沉淀,收集抗体-转录因子DNA复合物,逆转交联,对纯化DNA进行PCR分析,检测能否扩出目的片段。2. MRL/lpr狼疮小鼠Blimp1的表达：实时荧光定量PCR （RT-PCR）分别取MRL/lpr狼疮小鼠及正常老鼠的淋巴结和脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA,进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性,取两管平均Ct值计算2-ΔΔCT值,作为各标本mRNA的相对表达量。3、统计学处理,采用SPSS13.0进行统计分析,计量资料呈非正态分布,数据用中位数（Median）（四分位数间距IQR）描述,两组间比较采用非参数秩和检验（Mann-Whitney Test）分析,以P<0.05认为有统计学意义。结果：1、 Blimp1能够与BCMA特异性结合。EMSA实验证实了J558L细胞的核蛋白与“-38--42”位的‘GAAAC”位点结合形成了DNA-核蛋白复合物,且竞争性探针可以抑制此复合物的形成。加入抗Blimp1抗体时出现超阻滞条带。CHIP实验也证实了J558L细胞中Blimp1蛋白能与BCMA基因DNA结合。2、狼疮鼠组脾脏Blimp1mRNA的相对表达水平高于正常对照组Blimp1mRNA的相对表达水平。其中位数（四分位数间距）分别为0.655（0.426,0.799）和0.966（0.777,1.314）（Z=-2.609,P=0.009）；狼疮鼠组淋巴结中Blimp1的相对表达水平也高于正常对照组Blimp1mRNA的相对表达水平,中位数（四分位间距）分别为1.786（1.127,3.119）和7.338（6.482,10.199）（Z=-3.402,P=0.001）,差别有统计学意义。结论：1、Blimp1是浆细胞终极分化和存活的主调控子,可以直接调控BCMA基因表达,在维持浆细胞存活和功能中发挥重要作用。2、Blimp1mRNA表达在SLE狼疮鼠的脾脏、淋巴结中明显高于正常对照,提示Blimp1可能与SLE的发病过程相关,抑制Blimp1可能阻抑自身免疫中浆细胞功能,为开发治疗SLE等自身免疫性疾病的新药奠定基础。Blimp1将成为靶向浆细胞治疗SLE的新靶点。
论文目录
相关论文文献
- [1].靶向BCMA的CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤中的应用现状[J]. 免疫学杂志 2020(08)
- [2].系统性红斑狼疮患者静脉血BCMA和CD138~+浆细胞的研究[J]. 重庆医学 2012(07)
- [3].抗BCMA联合抗CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治多发性骨髓瘤:单臂Ⅱ期临床试验[J]. 临床血液学杂志 2020(04)
- [4].对抗BCMA单链抗体体外亲和力成熟关键位点的模拟[J]. 昆明理工大学学报(自然科学版) 2020(04)
- [5].血清BCMA和MIF含量与系统性红斑狼疮疾病活动性的关联度研究[J]. 临床和实验医学杂志 2013(01)
- [6].BCMA基因5'上游序列定点删除突变对启动子活性的影响[J]. 中国现代医学杂志 2009(07)
- [7].BCMA基因5′上游序列生物信息学分析[J]. 重庆医学 2008(03)
- [8].JNK信号通路活化与BCMA表达对MM细胞的作用研究[J]. 国际检验医学杂志 2016(22)
- [9].小鼠BCMA基因启动子活性研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2008(08)
- [10].B细胞成熟抗原（BCMA）靶向免疫治疗多发性骨髓瘤的研究进展[J]. 中国实验血液学杂志 2019(05)
- [11].靶向BCMA的第二代/三代CAR-T细胞构建及其抗肿瘤活性的体外研究[J]. 中国细胞生物学学报 2020(04)
- [12].科济生物CT053全人抗BCMA自体CAR T细胞注射液获得美国FDA批准[J]. 临床合理用药杂志 2019(17)
- [13].血清MIF及BCMA表达水平与SLE活动性的相关性研究[J]. 临床检验杂志 2011(06)