近江牡蛎类立克次体与宿主相互作用的分子生物学研究

论文摘要

宿主与病原的相互作用是国际微生物感染免疫学前沿领域的重要命题。类立克次体是一类严格细胞内寄生的革兰氏阴性微生物,导致养殖牡蛎的大量死亡,但对于其分子生物学和致病机理知之甚少。本研究主要采用类立克次体菌体细胞和外膜蛋白诱导刺激近江牡蛎宿主,系统探索了类立克次体病原与宿主的相互作用：即类立克次体菌体细胞诱导宿主核转录因子CREB, LITAF的免疫功能与机理及类立克次体外膜蛋白ompR诱导刺激后宿主的分子免疫反应机制以及信号传导途径。取类立克次体诱导刺激后的近江牡蛎血淋巴细胞,采用TRIzol法提取RNA,制备cDNA模板。根据CREB蛋白的保守结构特征设计了兼并寡聚核苷酸引物,采用RT-PCR和RACE PCR技术首次在双壳贝类中获得了Ca-CREB的全长cDNA序列。该cDNA序列含有一个1068 bp的读码框,编码一个39.3 kDa的蛋白,该蛋白具有转录因子CREB的特征性结构,与无脊椎动物海兔和蜗牛的CREB同源性较高,相似度分别为56%和58%。组织半定量RT-PCR结果表明：Ca-CREB在各组织中均有表达,但在血细胞和鳃中的表达量明显高于其它组织,预示该基因可能与免疫调节有关。通过构建重组表达质粒pET-CREB,在大肠杆菌中对Ca-CREB进行了诱导表达、蛋白纯化并制备了多克隆抗体,同时利用凝胶阻滞技术（EMSA）对重组蛋白的活性进行了研究。随后采用Real time RT-PCR、Western blotting和EMSA技术探讨了Ca-CREB在类立克次体诱导刺激条件下的激活机理及功能。结果表明：①Ca-CREB在大肠杆菌中得到了高效表达,获得的重组蛋白具有特异的DNA结合活性,制备的兔多克隆抗体的效价为1:12000。②在类立克次体诱导刺激不同时间段内,血淋巴细胞中Ca-CREB的基因表达水平没有显著差异,而Ca-CREB的DNA结合活性和磷酸化水平得到了明显提高,这表明核转录因子Ca-CREB在类立克次体诱导的宿主免疫反应中具有功能,且这种功能的激活发生在转录后水平上。接着,我们分别从表达载体、胶浓度及电泳条件等方面着手,对Ca-CREB原核表达产物比预测蛋白分子量偏大的原因进行了分析,结果表明：不同的表达载体及胶浓度对Ca-CREB融合蛋白在SDS-PAGE中表现的分子量大小没有影响,而不同SDS-PAGE体系分离融合蛋白时产生了融合分子量偏小的现象,推测不同的SDS-PAGE体系与分子量偏差的产生有关。鉴于类立克次体在菌体细胞水平上能够诱导刺激宿主发生上述免疫反应,为深入探讨类立克次体在蛋白分子水平上是否能够诱导刺激宿主的分子免疫反应机制及信号传导途径,本实验通过基因组测序方法获得了首个贝类类立克次体病原的外膜蛋白ompR基因并研究了其免疫功能。该基因全长531bp,编码176个氨基酸,预测的蛋白分子量和等电点分别为19.76 KDa和9.76。核酸和氨基酸序列分析表明该蛋白具有细菌外膜蛋白的特征,与人Q热立克次体和潮虫立克次体外膜蛋白ompH具有20%-27%的相似性。随后以上述同样方法进行了ompR重组蛋白的表达、纯化和多克隆抗体的制备。在功能研究上,采用实时定量PCR、EMSA等技术手段分析了ompR诱导刺激后,宿主多个免疫相关因子的免疫反应机制及信号传导,结果显示：①该蛋白得到了成功地表达,制备的多克隆抗体与近江牡蛎类立克次体的总外膜蛋白产生了特异性的免疫反应,在目的蛋白位置出现了单一的免疫反应条带,表明已经获得了类立克次体外膜蛋白ompR。②ompR诱导刺激后,宿主免疫相关因子Myd88和TNF-α的表达水平发生了明显变化,而TGF-β基因的表达水平不受影响；在转录后水平上的调控表现为刺激后血淋巴细胞中P38的磷酸化水平明显地增加,JNK的磷酸化水平急剧下降,而ERK的磷酸化水平无变化；同时核转录因子NF-κB的DNA结合活性的明显增加,而P38激酶抑制剂可显著地抑制该结合活性。在前面研究基础上,我们进一步克隆鉴定了近江牡蛎的LITAF（LPS-induced TNF-α）,并对其功能进行了初步研究。Ca-LITAF全长750 bp,具有一个348 bp的读码框,编码一个分子量大小约为12.5 kDa的蛋白。该蛋白具有Zn2+结合区（CXXC和HXCXXC）和LITAF结构域等特征性结构,与其它动物的LITAF蛋白的相似度介于33%和96%之间,其中与无脊椎动物太平洋长牡蛎和扇贝的LITAF蛋白具较高同源性,同属一个亚群。实时定量PCR结果显示：Ca-LITAF在各被检组织中均有表达,在鳃和血淋巴细胞的表达量要高于其它组织,类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中Ca-LITAF的表达明显增强,表明Ca-LITAF与病原诱导的宿主免疫反应有关。综合上述结果,病原/MAPKs/NF-κB （CREB）信号途径可能存在于牡蛎天然免疫系统中,对抵抗外来病原的入侵起着重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述及研究内容与技术路线
• 第一章 类立克次体研究进展
• 1 主要水生动物的类立克次体感染
• 1.1 贝类
• 1.2 鱼类
• 1.3 甲壳类
• 2 类立克次体的形态、特征
• 3 类立克次体的分类
• 4 类立克次体的检测
• 5 类立克次体的培养及分子生物学
• 第二章 核转录因子CREB的研究进展
• 1 CREB的发现及结构特点
• 2 CREB的活化和转录调控机制
• 3 CREB的功能
• 3.1 CREB与记忆
• 3.2 CREB与细胞增殖和凋亡
• 3.3 CREB与免疫应答
• 3.4 CREB与疾病
• 第三章 研究内容与技术路线
• 1 研究内容
• 2 技术路线概要
• 第二部分 近江牡蛎类立克次体与宿主核转录因子CREB相互作用研究
• 第四章 近江牡蛎CREB（Ca-CREB）全长cDNA的克隆与序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 总RNA的制备
• 2.2 Ca-CREB cDNA片段的克隆
• 2.3 Ca-CREB cDNA全长的克隆、鉴定与序列分析
• 2.4 Ca-CREB在正常牡蛎不同组织中的表达分析
• 3 讨论
• 第五章 Ca-CREB的原核表达,鉴定及蛋白活性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.2 重组蛋白的表达与纯化
• 2.3 多克隆抗体制备与Western blot分析
• 2.4 重组蛋白生物活性的鉴定
• 3 讨论
• 第六章 Ca-CREB在近江牡蛎免疫反应中的功能与机理研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 Ca-CREB表达的Real time RT-PCR分析
• 2.2 Ca-CREB磷酸化检测和分析
• 2.3 近江牡蛎血淋巴细胞中Ca-CREB的活性检测
• 3 讨论
• 第七章 SDS-PAGE法测定Ca-CREB融合蛋白分子量产生偏差的分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 pGEX-CREB重组质粒的构建
• 2.2 重组融合蛋白（CREB-GST）的表达
• 2.3 不同浓度SDS-PAGE分析重组融合蛋白（CREB-His）
• 2.4 不同SDS-PAGE体系分析重组融合蛋白
• 3 讨论
• 第三部分 近江牡蛎类立克次体外膜蛋白ompR的特性与功能分析
• 第八章 近江牡蛎病原-类立克次体外膜蛋白（ompR）的序列分析、表达及鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 近江牡蛎类立克次体基因组DNA的提取及鉴定
• 2.2 序列分析
• 2.3 原核表达载体的构建
• 2.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定
• 2.5 ompR重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测
• 2.6 近江牡蛎类立克次体外膜蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析
• 3 讨论
• 第九章 近江牡蛎类立克次体外膜蛋白（ompR）与宿主相互作用的机理
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 Real time RT-PCR分析
• 2.2 ompR对血淋巴细胞中ERK、JNK和P38磷酸化水平的影响
• 2.3 ompR对血淋巴细胞中NF-κB活性的影响
• 3 讨论
• 第四部分 近江牡蛎类立克次体诱导刺激后宿主LITAF基因的克隆鉴定
• 第十章 近江牡蛎LITAF（LPS-induced TNF-α）的克隆、表达及功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 Ca-LITAF基因片段的克隆
• 2.2 Ca-LITAF全长cDNA的克隆及序列分析
• 2.3 近江牡蛎不同组织中Ca-LITAF基因表达分析
• 2.4 类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中Ca-LITAF的表达分析
• 2.5 pET-Ca-LITAF重组质粒的构建
• 2.6 Ca-LITAF重组蛋白的表达和纯化
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的论文