论文摘要
背景与目的：舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,临床常规采用手术为主并辅以放、化疗的综合治疗方法。由于化疗易产生耐药性且其机制尚未阐明,影响了舌癌的治疗效果。TCRP1基因是我室采用EST介导的定位候选克隆策略从舌癌多药耐药细胞（Yca8113/pym）中克隆的一个舌癌耐药相关基因,体内外研究已初步证实TCRP1基因能特异性介导舌癌细胞对顺铂的耐受。但TCRP1基因启动子序列及转录调控机制尚不明确。本课题将在克隆TCRP1基因启动子、预测转录因子的基础上围绕基因转录调控规律开展相关研究,为阐述TCRP1基因在舌癌耐药中的作用机制提供新的理论依据。方法：（1）生物信息学分析TCRP1基因5’端调控区,预测TCRP1基因候选启动子区及转录起始位点,构建系列缺失片段荧光素酶报告基因重组质粒,转染舌癌细胞,检测荧光素酶活性,确定TCRP1基因启动子区域；（2）生物信息学分析能与TCRP1基因启动子结合的转录因子及其位点,对预测的转录因子c-Myc采用染色质免疫沉淀实验（CHIP）验证；（3）将c-Myc与TCRP1启动子报告载体pGL4+322/+709共转染至Tca8113细胞中,或在Tca8113/PYM细胞中转入pGL4+322/+709,再针对c-Myc进行抑制剂处理或RNA干扰后,通过荧光素酶活性分析检测c-Myc对TCRP1启动子活性的影响；（4） Western Blot检测Tca8113与Tca8113/PYM细胞中c-Myc的表达差异；将c-Myc转入Tca8113细胞,或在Tca8113/PYM细胞对c-Myc进行抑制剂处理或RNA干扰后,采用RT-PCR、Western Blot检测细胞中TCRP1表达的变化,MTS实验检测细胞对顺铂耐药性的改变。结果：（1）生物信息学预测TCRP1基因启动子位于-939bp至+700bp区域,且存在多个转录起始位点。荧光素酶报告基因实验确定TCRP1基因5’端+322/+709区间为其启动子所在区域,且在Tca8113/PYM细胞中的启动活性高于Tca8113细胞；（2）生物信息学分析TCRP1基因启动子区为—不含TATA盒与CAAT盒的GC富集区,并含有AP2,ADR1,Spl,NF-1,RAF和c-Myc等多种转录因子结合位点,CHIP实验表明转录因子c-Myc能与TCRP1基因启动子区结合；（3）荧光素酶报告基因实验证实c-Myc可上调TCRP1基因启动子活性；（4）c-Myc在Tca8113/PYM细胞中的表达比Tca8113细胞高；c-Myc外源性高表达细胞（Tca8113/c-Myc）中TCRP1 mRNA与蛋白表达增加,细胞对顺铂耐受增强；c-Myc表达沉默细胞（Tca8113/PYM-i）中TCRP1 mRNA与蛋白表达降低,细胞对顺铂耐受降低。结论：（1）TCRP1基因的启动子位于其5’端+322/+709区域；（2）TCRP1基因启动子是一个不含TATA盒与CAAT盒的GC富集区,并含有AP2,ADR1,Spl,NF-1,RAF和c-Myc等多种转录因子结合位点：（3）转录因子c-Myc可与TCRP1基因启动子区特异性结合,增强其启动活性,使舌癌细胞对顺铂耐受增强。
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相关论文文献
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- [2].TCRP1通过PI3k-Akt途径介导口腔鳞癌顺铂化学治疗耐受[J]. 国际病理科学与临床杂志 2012(06)
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- [4].C-myc上调TCRP1表达与舌癌细胞对顺铂耐受相关[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2014(03)
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