猪嗜血支原体PCR和ELISA抗体检测方法的建立与应用

论文摘要

猪嗜血支原体(Mycoplasma suis, M. suis)是一种寄生于红细胞表面的病原微生物,临床上急性感染猪可发生致死性溶血性贫血,慢性感染则表现为轻度贫血,消瘦,繁殖机能障碍等。猪嗜血支原体病在全球范围内广泛分布,给养猪业带来了严重的经济损失,但诊断技术研究不多。本菌在体外尚不能培养。16S rRNA是M. suis的保守序列之一,也是病原分类的主要依据。MSG1蛋白是M. suis的一种重要的表面黏附蛋白,可能也是一种致病因子。本研究具体内容如下：1.猪嗜血支原体PCR及荧光定量PCR检测方法的建立和比较根据已发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因序列(FJ263944)设计合成PCR引物和荧光定量PCR引物及探针,以含16S rRNA基因的重组质粒为阳性模板,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测猪嗜血支原体的PCR和荧光定量PCR检测方法。PCR和荧光定量PCR分别能够检测出104个和10个拷贝的核酸分子,同PCR方法相比,荧光定量PCR方法敏感性提高了1000倍；用两种方法对猪霍乱沙门氏菌、肠致病性大肠杆菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、圆环病毒2型基因组DNA进行扩增,结果均为阴性；用这两种PCR方法检测20份临床样品,PCR方法的阳性率为60%(12/20),而荧光定量PCR方法的阳性率为75%(15/20),证明这两种检测方法都有很好的敏感性和特异性。2.猪嗜血支原体MSG1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定以原核表达纯化的猪嗜血支原体MSG1蛋白免疫BALB/c小鼠,运用细胞融合技术筛选分泌针对MSG1蛋白抗体的融合细胞。通过间接ELISA方法筛选获得两株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7和3G6,Western blot结果证明这两株单克隆抗体能够与重组MSG1发生特异性反应,间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能与天然抗原特异性结合。单抗1A7和3G6细胞上清和腹水中的ELISA抗体效价分别为1：4096、1：1024和1：1638400、1：51200,体外培养连续传代至第20代,分泌抗体的效价基本一致,其单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型,抗原识别位点相同。3.猪嗜血支原体阻断ELISA检测方法的建立和初步应用以纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和辣根过氧化酶标记的MSG1蛋白单抗,建立阻断ELISA方法用于检测猪嗜血支原体抗体。经筛选优化的反应条件为：抗原包被浓度为0.5μg/mL,封闭液为5%脱脂乳,封闭时间为37℃3h,待检血清稀释度为1：1,其作用时间为37℃1.5h,酶标单抗稀释度为1：5000,作用时间为37℃1h,37℃显色15min。通过对50份M. suis阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为：当阻断率(PI)≥37.25%时为阳性,PI≤25.44%时为阴性,25.44%<PI<37.25%时为可疑。应用本方法对100份血清样品进行检测,以间接ELISA结果为标准,阻断ELISA的敏感性和特异性分别为92%和100%,表明本方法敏感性高特异性好。使用本研究建立的阻断ELISA方法检测猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪脑心肌炎病毒参考阳性血清,结果均为阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均小于10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用该阻断ELISA方法检测不同地区送检的310份临床血清,总阳性检测率为52.26%,证明我国很多地区的猪场都存在M. suis感染的现象。综上所述,本研究制备获得2株抗M. suis MSG1蛋白的单克隆抗体,成功建立病原的PCR检测方法和ELISA抗体检测方法,为该病诊断和流行病学研究奠定了物质基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪嗜血支原体的研究进展
• 1 猪嗜血支原体的病原学
• 1.1 起源与分类地位
• 1.2 形态及理化特性
• 1.3 分子生物学特点
• 1.4 与宿主的相互作用及宿主的免疫机制
• 2 猪嗜血支原体的流行病学
• 3 猪嗜血支原体病的临床症状和病理变化
• 4 猪嗜血支原体的检测方法
• 4.1 形态学检测
• 4.2 血清学检测
• 4.3 分子生物学检测
• 4.4 动物试验
• 5 猪嗜血支原体病的防治
• 5.1 预防
• 5.2 治疗
• 参考文献
• 第二章 猪嗜血支原体PCR及与荧光定量PCR检测方法的建立和比较
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 病料来源
• 1.2 试剂、菌株和毒株
• 1.3 引物及探针
• 1.4 猪嗜血支原体16S rRNA重组质粒的构建
• 1.5 PCR检测方法的建立
• 1.6 FQ-PCR检测方法的建立
• 1.7 两种方法对临床样品检测的比较
• 2 结果
• 2.1 标准阳性质粒的构建
• 2.2 PCR方法的建立
• 2.3 FQ-PCR方法的建立
• 2.4 两种方法对临床样品检测的比较
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 猪嗜血支原体MSG1蛋白单克隆抗体的制各及鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、细胞、实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 抗原蛋白和检测蛋白的制备
• 1.4 动物免疫
• 1.5 间接ELISA方法检测多抗效价
• 1.6 单克隆抗体的制备
• 1.7 单克隆抗体的鉴定
• 2 结果
• 2.1 抗原蛋白制备及纯化
• 2.2 杂交瘤细胞株的筛选
• 2.3 MAb的特异性鉴定
• 2.4 单抗的Ig型鉴定
• 2.5 单抗的抗原位点分析
• 2.6 间接免疫荧光试验
• 2.7 杂交瘤细胞株分泌MAb的稳定性鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第四章 猪嗜血支原体阻断ELISA检测方法的建立和应用
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂、菌株、细胞及血清
• 1.2 抗原蛋白的制备
• 1.3 单克隆抗体的纯化及辣根过氧化酶（HRP）标记
• 1.4 阻断ELISA术式
• 1.5 阻断ELISA最佳反应条件的选择
• 1.6 阻断ELISA临界值的确定
• 1.7 阻断ELISA的重复性试验
• 1.8 阻断ELISA的敏感性试验
• 1.9 阻断ELISA特异性试验
• 1.10 临床血清样品的检测
• 2 结果
• 2.1 单克隆抗体的纯化和HRP标记
• 2.2 阻断ELISA最佳反应条件的选择
• 2.3 阻断ELISA临界值的确定
• 2.4 阻断ELISA的重复性试验
• 2.5 阻断ELISA的敏感性试验
• 2.6 阻断ELISA特异性试验
• 2.7 临床血清样品的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 附录