论文题目: 人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 临床兽医学
作者: 华进联
导师: 窦忠英
关键词: 胚胎干细胞,原始生殖细胞,胚胎生殖细胞,无血清培养,心肌细胞
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
论文目录:
文献综述
第一章 原始生殖细胞发育与分化
1 原始生殖细胞的起源
1.1 小鼠原始生殖细胞的起源
1.2 影响小鼠原始生殖细胞起源的因素
1.3 人类原始生殖细胞的起源
2 原始生殖细胞的发生
2.1小鼠原始生殖细胞的发生
2.2人类原始生殖细胞的发生
3 PGCs发生和发育的有关基因及分子特征
3 1 frigilis和stella
3.2 Oct-4基因
3.3 Nanog
3.4.其它相关基因
4 PGCs的迁移
4.1 PGCs的迁移路径
4.2影响PGCs迁移的因素
5 原始生殖细胞与性别分化
6 生殖细胞的基因修饰
第二章 PGCs源的哺乳动物EG细胞研究进展
1 哺乳动物胚胎生殖细胞研究简史
2 胚胎生殖细胞的分离培养及影响因素
2.1 PGCs分离纯化和胚胎生殖细胞分离培养
2.2 影响胚胎生殖细胞分离培养的因素
3 胚胎生殖细胞的检测
3.1 形态学鉴定
3.2 细胞表面标志物
3.3 核型分析
3.4 EGN胞端粒酶活性
3.5 EGN胞的高度分化潜能
4 自PGCs分离克隆各种哺乳动物EGN胞的研究进展
4.1 小鼠
4.2 大鼠
4.3 兔
4.4 猪
4.5 羊
4.6 牛
4.7 人
5 影响PGCs与EG细胞生长增殖的机理
5.1 干细胞因子
5.2 bFGF和FGF受体
5.3 IL/LIF家族细胞因子
6 关于哺乳动物PGCs源EG细胞分离克隆的几个问题探讨
6.1 PGCs转化成EG细胞
6.2 EG细胞不能完全替代ES细胞
6.3 EG细胞分离克隆和诱导分化特性
第三章 人类胚胎干细胞的研究进展
1 人类胚胎干细胞的来源与培养方法
1.1 囊胚法(正常体内受精胚胎和体外受精胚胎)
1.2 克隆胚胎法
1.3 孤雌激活胚胎法
1.4 其他途径来源的hES细胞的分离培养
2 建立和维持hESCs系的条件
2.1 饲养层
2.2 培养基组成
3 hES细胞的生物学特性及鉴定方法
4 hES细胞的储藏
4.1 ES细胞的冷冻与解冻
4.2 hES细胞登记储存
5 人类胚胎干细胞研究进展
5.1 由早期胚胎分离克隆hES细胞
5.2 由克隆胚胎分离克隆ES细胞研究
5.3 hES细胞的遗传操作
5.4 hES细胞定向分化的研究
6 人类胚胎干细胞研究存在的问题及急需解决的问题
6.1 伦理道德之争
6.2 无饲养层和无血清培养体系高效快速大规模扩增hESCs体系的建立
6.3 ES细胞向特定类型重要功能细胞分化的技术
6.4 ES细胞源特定分化细胞的扩增与筛选纯化
6.5 ES细胞源细胞移植治疗的免疫排斥问题
6.6 ES细胞源细胞移植治疗的安全性问题
7 人类胚胎干细胞研究的趋势与前景
8 世界上一些已建系的实验室对人类ES细胞的管理规则
第四章 ES细胞体外定向诱导分化
1 胚胎干细胞增殖与分化的信号调节机制
1.1 STAT3 信号通路对胚胎干细胞增殖及分化的调节
1.2 ERK信号通路对胚胎干细胞增殖及分化的调节
1.3 Nanog对ES细胞多能性的维持
2 ES细胞体外诱导分化
2.1 ES细胞体外诱导分化的意义
2.2 ES细胞体外诱导分化的基本原理
2.3 ES细胞体外定向诱导分化方法
2.4 诱导分化程序
2.5 ES细胞体外诱导分化细胞类型
3 胚胎干细胞诱导分化研究展望
第五章 ES、EG细胞与生殖细胞
1 生殖细胞的发生和细胞标记
1.1 生殖细胞的发生
1.2 生殖细胞的特异性标记
2 ES、EG细胞与生殖细胞的关系
2.1 ES、EG细胞与生殖细胞的相似性
2.2 ES、EG细胞向生殖细胞分化
2.3 ES、EG细胞与生殖细胞的区别
结语
试验研究
第六章 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究
1 材料与方法
1.1 组织材料
1.2 试剂
1.3 方法
2 结果
2.1 人胚胎生殖嵴/性腺的形态与定位
2.2 HE染色观察结果
2.3 PAS染色观察结果
2.4 免疫组织化学染色观察结果
2.5 人胚胎性腺生殖细胞的AKP染色
2.6 人胚胎性腺生殖细胞的超微结构
3 讨论
3.1 人胚胎睾丸生殖细胞的发育分化
3.2 人胚胎卵巢生殖细胞的发育分化
4 小结
第七章 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 各种饲养层细胞的分离培养与生长
2.2 培养液对各种饲养层细胞生长的影响
2.3 流产胎儿对PGCs分离克隆的影响
2.4 消化液和消化时间及PERCOLL密度梯度纯化对流产儿PGCs分离克隆的影响
2.5 细胞外基质对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响
2.6 培养液及添加物对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响
2.7 饲养层
3 讨论
3.1 胎儿对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响
3.2 消化液和消化时间及PERCOLL密度梯度纯化对PGCs分离克隆的影响
3.3 细胞外基质与人类胚胎生殖细胞分离克隆
3.4 细胞因子对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响
3.5 条件培养液与人类胚胎生殖细胞分离克隆
3.6 饲养层细胞类型对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响
4 小结
第八章 人类EG细胞的无血清培养及检测
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 人类EG细胞的无血清分离培养
2.2 人类EG细胞的检测
3 讨论
3.1 人类EG细胞的无血清分离培养
3.2 人类EG细胞的生物学特性及检测
4 小结
第九章 人类EG细胞体外定向诱导分化
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 人类胚胎生殖细胞的分离培养和表面标记
2.2 人类EG细胞体外向心肌细胞诱导分化及检测
2.3 人类EG细胞体外向神经细胞分化及检测
2.4 人类EG细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化及检测
3 讨论
3.1 人类EG细胞向心肌细胞诱导分化
3.2 人类EG细胞向神经细胞诱导分化
3.3 人类EG细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化及检测
4 小结
第十章 人类胚胎生殖细胞转染心肌Α-ACTIN的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 hEGCs的转染、筛选与增殖
2.3 免疫组化检测
2.4 转染α-actin 的hEGCs向心肌细胞的诱导分化
3 讨论
3.1 hEGCs的转染、筛选与增殖
3.2 α-actin在hEGCs中的表达
4 小结
结论
创新点
进一步研究的课题
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-12-22
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