扩展蛋白与植物激素调节的干旱胁迫下小麦细胞生长的关系研究

论文摘要

干旱是作物生长过程中经常遇到的逆境胁迫之一,近年来,由于气候变化导致的干旱灾害呈逐年增加的趋势。小麦是世界性的粮食作物,干旱胁迫严重影响小麦的生长和产量。研究小麦的抗旱生理及分子机制,通过遗传操作增强小麦抗旱性,培育抗旱型小麦品种,对于保障小麦高产稳产具有重大意义。干旱逆境下植物最明显的生理响应是生长受到抑制。植物生长涉及到细胞伸长和细胞分裂两个方面。业已证明,细胞的伸长生长比细胞分裂对干旱胁迫更敏感。细胞伸长生长过程取决于两个因素,一是膨压驱动产生的生长动力,二是由于细胞壁刚性造成的生长阻力。早期的研究结果认为,细胞膨压在细胞伸长生长过程中起主导作用。后来越来越多的研究认为,植物细胞壁的可塑性在调控植物细胞延伸生长对水分亏缺的应答方面具有更重要的作用。扩展蛋白在克服细胞壁阻力,维持细胞伸长生长过程中具有重要作用。扩展蛋白是一种细胞壁蛋白,具有使热失活细胞壁恢复伸展能力的特性。扩展蛋白通过打破细胞壁纤维素和半纤维素之间的氢键,促使两者发生位移,来调节细胞壁的伸展性。已有研究证明,扩展蛋白响应外界环境胁迫,参与调节干旱条件下植物细胞的生长反应。植物激素作为重要的信号调节物质,不仅与植物的生长发育关系密切,而且在调节植物抗逆性过程中起着重要的作用。已有研究发现许多扩展蛋白基因的表达受到植物激素的调控。那么,扩展蛋白与植物激素调节的抗旱性之间是否存在关联呢?小麦胚芽鞘细胞在胚中已经分化完成,种子萌芽过程中的胚芽鞘生长主要是细胞的伸长生长,因此胚芽鞘是研究细胞伸长生长的模式材料。在本研究中,选择2个抗旱性不同的小麦品系抗旱型HF9703和干旱敏感型921842,取其胚芽鞘作为研究细胞伸长生长的材料,通过干旱胁迫处理和植物激素（ABA和IAA）处理,研究干旱胁迫条件下,植物激素对细胞伸长生长的调节作用,分析扩展蛋白在植物激素介导的小麦抗旱性中的作用。主要结论如下:1扩展蛋白调节干旱胁迫下小麦胚芽鞘细胞伸长生长（1）干旱胁迫下小麦细胞伸长生长与扩展蛋白活性关系密切PEG模拟的干旱胁迫明显抑制了小麦胚芽鞘的伸长生长,抗旱性强的小麦品系HF9703胚芽鞘生长明显快于干旱敏感型的小麦品系921842。用扩展蛋白抗体作为扩展蛋白的作用抑制剂处理小麦胚芽鞘,明显抑制了小麦胚芽鞘的伸长生长。干旱胁迫没有改变小麦胚芽鞘细胞壁对扩展蛋白的敏感性,但显著提高了小麦胚芽鞘中扩展蛋白活性,而且抗旱型小麦HF9703胚芽鞘中扩展蛋白活性明显大于干旱敏感型小麦921842。说明扩展蛋白参与干旱胁迫下小麦胚芽鞘细胞伸长生长的调节,可能在小麦细胞伸长生长对干旱胁迫的响应过程中起作用。（2）干旱胁迫通过上调扩展蛋白表达提高了扩展蛋白活性Western-Blot检测分析结果证明,干旱胁迫诱导扩展蛋白表达增加,抗旱型小麦HF9703胚芽鞘中扩展蛋白的积累量明显高于干旱敏感型小麦921842。该结果与扩展蛋白活性对干旱胁迫的响应相一致。水分胁迫后的复水实验证明,干旱胁迫诱导的扩展蛋白积累有利于复水后小麦胚芽鞘生长的加速。这些结果表明,扩展蛋白在干旱胁迫下积累,提高了扩展蛋白活性,这对于维持干旱胁迫条件下小麦胚芽鞘的生长,提高小麦抗旱性有着重要作用。（3）干旱胁迫导致细胞壁碱化降低扩展蛋白活性不利于细胞伸长生长扩展蛋白活性依赖于细胞壁的酸性。对小麦胚芽鞘细胞壁酸碱度及质膜H+-ATPase的活性检测结果发现,干旱胁迫降低细胞壁酸度,导致细胞壁碱化,这与质膜H+-ATPase的活性降低密切相关。抗旱性强的小麦品系HF9703的H+-ATPase活性高于抗旱性弱的921842。扩展蛋白活性是酸依赖性的,因而细胞壁的碱化会导致扩展蛋白活性降低,对细胞的伸长生长不利。干旱胁迫下提高外界环境的酸性促进了小麦胚芽鞘的生长,间接说明干旱胁迫下胚芽鞘的生长抑制与细胞壁碱化有关。虽然干旱胁迫诱导了扩展蛋白活性增加,提高了细胞壁的可塑性,减小了细胞的生长阻力,但是干旱胁迫依然抑制了胚芽鞘的生长。这种生长抑制可能是生长动力（膨压）降低的结果。扩展蛋白活性的提高可以在一定程度上减轻干旱胁迫对细胞伸长生长的抑制作用。2干旱胁迫下ABA通过上调扩展蛋白表达提高扩展蛋白活性,从而提高小麦抗旱性（1）外源ABA处理抑制了小麦胚芽鞘细胞的伸长生长。干旱胁迫条件下,小麦胚芽鞘中ABA含量增加,而且抗旱性强的HF9703小麦胚芽鞘中ABA含量高于干旱敏感型的921842。ABA合成抑制剂FLU缓解了干旱胁迫对胚芽鞘细胞生长的抑制作用。说明ABA参与调节干旱胁迫对小麦胚芽鞘伸长生长的抑制。（2）外源ABA的应用抑制小麦胚芽鞘的伸长生长,在这一过程中,扩展蛋白活性增加,这与扩展蛋白对干旱胁迫的响应相一致。而FLU则抑制了干旱胁迫对扩展蛋白活性的促进作用。免疫印迹分析证明,ABA上调扩展蛋白表达,促进扩展蛋白积累,这可能是ABA提高扩展蛋白活性的主要原因。（3）ABA处理引起质膜H+-ATPase活性下降,导致小麦胚芽鞘细胞壁碱化,这不利于扩展蛋白活性。干旱胁迫下抗旱性强的HF9703小麦胚芽鞘中质膜H+-ATP酶活性高于干旱敏感型的921842,细胞壁碱化程度弱于921842。细胞壁碱化导致的扩展蛋白活性降低会加大细胞壁扩张阻力,这不利于细胞的伸长生长。3外源IAA调节的细胞壁酸化有利于扩展蛋白活性提高和细胞的伸长生长（1）离体处理条件下,外源IAA处理促进小麦胚芽鞘的生长,同时提高小麦胚芽鞘中扩展蛋白活性。检测细胞壁酸碱度和质膜H+-ATP酶活性发现,IAA处理导致小麦胚芽鞘质膜H+-ATP酶活性提高,同时促使细胞壁酸化程度增加。但是IAA处理对小麦胚芽鞘中扩展蛋白含量的影响不明显。说明IAA通过调节小麦细胞壁酸化,提高了扩展蛋白活性,进而促进了小麦细胞的伸长生长。（2）然而,根施IAA对小麦胚芽鞘的伸长生长几乎没有影响;扩展蛋白活性和表达在根施IAA处理后都没有明显的变化,这可能与小麦根系对外源IAA吸收或者IAA的运输不畅有关。根施IAA后小麦胚芽鞘中内源IAA含量变化分析结果也证明了这一推测。（3）干旱胁迫下,小麦胚芽鞘中IAA含量几乎没有变化;根施IAA也几乎没有影响干旱胁迫对小麦胚芽鞘伸长生长的抑制作用。因而,IAA在小麦抗旱性适应过程中的作用还不清楚。4不同家族扩展蛋白基因表达对干旱胁迫以及植物激素IAA和ABA的响应扩展蛋白由一个大的基因家族编码。本文选择了小麦中6个不同家族的扩展蛋白基因,包括3个β-扩展蛋白家族基因TaEXPB23,TaEXPB1和TaEXPB2,3个-扩展蛋白家族基因TaEXPA1,TaEXPA2和TaEXPA3,半定量RT-PCR检测基因表达对干旱胁迫及植物激素的响应。结果表明,无论正常供水还是干旱胁迫下,TaEXPA1和TaEXPA2基因在小麦胚芽鞘中均没有表达,ABA以及IAA处理也均未检测到他们的表达,说明扩展蛋白表达具有位置效应。其它4个扩展蛋白基因的表达对干旱和ABA及IAA的响应不同。TaEXPB23、TaEXPB1、TaEXPB2和TaEXPA3的表达均被干旱胁迫诱导上调;IAA对其表达有轻微的上调,但不明显;ABA处理诱导TaEXPB23、TaEXPB2和TaEXPA3等3个基因的表达上调,而对TaEXPB1的表达基本没有影响。这表明小麦胚芽鞘中扩展蛋白是一个多基因家族,每个成员表达模式不同,受不同因素的调控。有些扩展蛋白基因的表达对干旱胁迫产生响应,且这种响应可能有ABA的参与。扩展蛋白基因表达对干旱胁迫的反应与小麦品种的抗旱性有关。

论文目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 扩展蛋白的发现

1.2 扩展蛋白的基因家族及蛋白结构

1.2.1 扩展蛋白的基因家族

1.2.2 扩展蛋白基因进化

1.2.3 扩展蛋白的蛋白结构

1.3 扩展蛋白的生化特性

1.3.1 细胞定位

1.3.2 扩展蛋白的作用机理

1.3.3 扩展蛋白与细胞壁的结合特性

1.3.4 扩展蛋白基因表达与功能特异性

1.4 扩展蛋白在植物生长发育中的功能

1.4.1 植株生长

1.4.2 茎与叶柄的伸长生长

1.4.3 叶片发育

1.4.4 根系生长和根毛发育

1.4.5 种子萌发

1.4.6 扩展蛋白与植物的生殖生长

1.4.6.1 雄配子体的发育

1.4.6.2 种子的形成和胚胎发生

1.4.6.3 花的发育

1.4.7 果实发育过程

1.5 扩展蛋白基因的表达调控

1.5.1 发育进程的调控

1.5.2 植物激素的调控

1.5.3 扩展蛋白启动子

1.5.4 环境因子对扩展蛋白的影响

1.6 展望

1.7 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 材料培养

2.1.3 材料处理

2.1.3.1 干旱胁迫处理

2.1.3.2 IAA 及其抑制剂TIBA 处理

2.1.3.3 ABA 及其抑制剂FLU 处理

2.1.3.4 干旱和植物激素共处理

2.1.4 酶及生化试剂

2.1.5 PCR 引物

2.2 实验方法

2.2.1 小麦胚芽鞘细胞壁蛋白的提取

2.2.1.1 Hepes 法提取小麦胚芽鞘细胞壁蛋白

2.2.1.2 SDS 法提取小麦胚芽鞘细胞壁蛋白

2.2.1.3 蛋白质浓度的测定

2.2.2 小麦胚芽鞘细胞壁酸伸展性以及外源扩展蛋白敏感性检测

2.2.2.1 不同干旱处理的小麦胚芽鞘细胞壁酸伸展性检测

2.2.2.2 小麦胚芽鞘细胞壁对扩展蛋白的敏感性检测

2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-Blot 检测扩展蛋白含量

2.2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.2.3.2 半干法蛋白转移

2.2.3.3 封闭及杂交

2.2.3.4 显色反应

2.2.4 抗体制备

2.2.4.1 抗体的获得

2.2.4.2 抗血清效价的测定

2.2.5 扩展蛋白抗体抑制小麦胚芽鞘生长

2.2.6 细胞壁酸化分析

2.2.7 质膜H+-ATPase 活性测定

2.2.7.1 质膜的提取和纯化

2.2.7.2 质膜H+-ATPase 活性测定

2.2.8 激素含量测定

2.2.8.1 植物激素的提取

2.2.8.2 植物激素含量HPLC 分析

2.2.9 RT-PCR 检测扩展蛋白基因的表达

2.2.9.1 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA

2.2.9.2 甲醛变性胶电泳

2.2.9.3 反转录cDNA 第一链的合成

2.2.10 统计分析

3 结果与分析

3.1 干旱胁迫下小麦胚芽鞘生长与扩展蛋白的关系研究

3.1.1 干旱胁迫对不同抗旱性小麦胚芽鞘伸长生长的影响

3.1.2 干旱胁迫对不同抗旱性小麦胚芽鞘内源扩展蛋白活性的影响

3.1.3 扩展蛋白抗体对小麦胚芽鞘生长的抑制作用

3.1.4 干旱胁迫下小麦胚芽鞘细胞壁伸展性对外源扩展蛋白敏感性的变化

3.2 细胞壁酸化以及扩展蛋白含量对干旱胁迫的响应

3.2.1 干旱胁迫对小麦胚芽鞘细胞壁酸化的影响

3.2.2 干旱胁迫对小麦胚芽鞘质膜H+-ATPase 活性的影响

3.2.3 干旱胁迫对小麦胚芽鞘扩展蛋白表达的影响

3.3 扩展蛋白与植物激素调节的小麦抗旱性关系研究

3.3.1 IAA 和ABA 对不同干旱胁迫条件下小麦胚芽鞘生长的作用

3.3.1.1 IAA 及其抑制剂对不同干旱胁迫条件下小麦胚芽鞘生长的影响

3.3.1.2 ABA 及其抑制剂对不同干旱胁迫条件下小麦胚芽鞘生长的影响

3.3.2 干旱胁迫以及IAA 和ABA 处理对小麦胚芽鞘中IAA 和ABA 含量的影响

3.3.3 外源IAA 和ABA 处理对小麦胚芽鞘扩展蛋白活性的影响

3.3.4 外源IAA 和ABA 对小麦胚芽鞘细胞壁酸化及质膜H+-ATPase 活性的影响

3.3.5 外源IAA 和ABA 处理对小麦胚芽鞘扩展蛋白表达表达的影响

3.4 小麦扩展蛋白基因表达对干旱胁迫及植物激素IAA 和ABA 的响应

3.4.1 干旱胁迫对小麦胚芽鞘中不同家族扩展蛋白基因表达的影响

3.4.2 植物激素ABA 对小麦胚芽鞘中不同扩展蛋白基因表达的影响

3.4.3 植物激素IAA 对小麦胚芽鞘中不同扩展蛋白基因表达的影响

4 讨论

4.1 扩展蛋白与干旱胁迫下细胞的伸长生长及小麦抗旱性关系

4.2 植物激素ABA 诱导扩展蛋白表达上调提高小麦抗旱性

4.3 植物激素IAA 调节的扩展蛋白活性在小麦细胞伸长生长过程中的作用

4.4 植物激素与扩展蛋白在干旱胁迫下小麦胚芽鞘生长过程中的协同作用

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

扩展蛋白与植物激素调节的干旱胁迫下小麦细胞生长的关系研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢