杉木的遗传转化研究

杉木的遗传转化研究

论文摘要

杉木(Cunninghamia lanceolata Hook.)为我国特产,分布于长江流域以南各省区,是南方重要的速生用材针叶树种之一。近几十年, 杉木病害日趋严重——本研究开展杉木转抗病基因实验的目的与意义即在于此。本实验在已经取得杉木组培快繁系统的基础上,以杉木试管苗的茎段为外植体,进行了一系列有关杉木转基因的研究:遗传转化受体系统的建立,转基因瞬时表达研究与稳定表达研究。通过改变预培养时间、蔗糖浓度、6-BA、TDZ、头孢霉素、卡那霉素浓度,探讨该因素对茎段再生不定芽的影响,最终建立了以茎段为外植体的高频再生系统。研究发现,DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ0.001mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20g/L 培养基对杉木茎段芽的诱导最有效,预培养2 d 时,芽诱导频率、平均芽数和芽形成能力最高,分别为100%、6.35和6.35。在之后的转化实验中皆采用该培养基进行茎段的芽诱导。   利用GUS 基因的酶学特性,进行瞬时表达研究,目的是在短期内优化转化条件。通过改变预培养时间、共培养时间、AS 浓度、pH 值、侵染时间与浓度、菌体的活化方式等因素,比较其对GUS+表达率和表达量的影响,最终优化了一系列的转化条件:预培养2 天、共培养3 天、pH 值5.60、侵染时间4~8min、侵染浓度OD600=0.2。     将修正后的优化转化条件,应用于稳定表达实验即转抗病基因实验中。根据GAFP 基因具有的抑菌活性作用,将其整合入EHA105 农杆菌用于实验。通过采用不同的取材方式与培养条件进行转基因实验,统计比较不同AS 浓度下受体茎段的分化率与褐化率。光培养条件下AS60μmol/L 时茎段的分化率最高,AS20μmol/L 最低;暗培养条件下茎段的过低的分化率,说明这种培养方式不适宜用于杉木的转化实验;总体而言,AS40μmol/L 的褐化率明显最高,AS20、80μmol/L 的褐化率表现得较低。在严格的筛选步骤下,本实验最终仅获得两棵Kmr芽,其中有一棵通过PCR 实验证实是假阳性苗,另一棵由于生长缓慢,目前无法进行检测。如此低的转化率主要可能是杉木较为复杂的内环境造成的。如此低的转化率,推测是由于杉木复杂的内环境及仍未探询到更为高效的再生的受体材料等原因引起的。杉木的遗传转化仍有待进一步的研究。

论文目录

  • 第一章 针叶树遗传转化研究进展
  • 1. 针叶树遗传转化方法
  • 1.1 农杆菌介导的针叶树遗传转化
  • 1.2 基因枪法
  • 1.3 电激法
  • 1.4 PEG 法
  • 2. 报告基因 GUS 在植物转基因中的应用
  • 2.1 GUS 基因的来源
  • 2.2 GUS 基因的酶学特性及其化学分析
  • 2.3 GUS 在针叶树转基因中的应用
  • 3.G AFP 在遗传转化中的应用
  • 4. 本实验相关研究内容的综述
  • 4.1 转化实验中外植体的选择
  • 4.2 TDZ 对外植体分化的影响
  • 4.3 预培养对转化的影响
  • 4.4 共培养对转化的影响
  • 4.5 AS 对转化的影响
  • 4.6 pH 值对转化的影响
  • 4.7 菌液浓度对转化的影响
  • 4.8 浸染时间对转化的影响
  • 4.9 活化方式对转化的影响
  • 4.10 瞬时表达研究与稳定表达研究
  • 4.11 转化实验中 Km 的应用
  • r 芽的影响'>4.12 Km 添加的时机与方式对产生 Kmr芽的影响
  • 4.13 抑菌素的作用
  • 5. 针叶树遗传转化存在的主要问题及解决办法
  • 6. 本研究目的及意义
  • 第二章 杉木遗传转化受体系统的建立
  • 1、前言
  • 2、材料和方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 外植体的获得
  • 2.2.2 培养基
  • 2.2.3 培养条件
  • 2.2.4 数据统计方法
  • 3. 实验结果与分析
  • 3.1 6-BA 浓度对芽诱导的影响
  • 3.2 TDZ 浓度对芽诱导的影响
  • 3.3 蔗糖浓度对芽诱导的影响
  • 3.4 预培养时间对芽诱导的影响
  • 3.5 Cef 对芽诱导的影响
  • 3.6 Km 对芽诱导及伸长生长的影响
  • 3.7 Km 对生根的影响
  • 4. 总结与讨论
  • 4.1 细胞分裂素浓度与芽的伸长生长
  • 4.2 接受转化的细胞与再生细胞的一致性
  • 4.3 芽的发育阶段与 Km 抗性
  • 第三章 杉木转基因瞬时表达研究
  • 1. 前言
  • 2 材料和方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 转基因受体材料
  • 2.1.2 试剂
  • 2.1.3 质粒和菌株
  • 2.1.4 培养基
  • 2.1.5 仪器与设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 杉木茎段遗传转化方法
  • 2.2.1.1 菌液的制备
  • 2.2.1.2 受体材料的预处理
  • 2.2.1.3 侵染
  • 2.2.1.4 设置正、负对照
  • 2.2.1.5 侵染茎段的 GUS 活性检测
  • 3. 实验结果与分析
  • 3.1 被侵染茎段的 GUS 活性检测
  • 3.1.1 关于瞬时表达率的指标的探讨
  • 3.1.2 影响杉木茎段瞬时表达率的因素
  • 3.1.2.1 预培养时间对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.2 共培养时间对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.3 共培养基中 AS 浓度对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.4 共培养基的pH 对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.5 浸染菌液的浓度对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.6 浸染时间对瞬时表达率的影响
  • 3.1.2.7 活化培养基对瞬时表达率的影响
  • 4. 转化条件的优化
  • 5. 总结
  • 第四章 杉木转天麻抗真菌蛋白研究
  • 1. 前言
  • 2. 材料和方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 转基因受体材料
  • 2.1.2 试剂
  • 2.1.3 质粒与菌株
  • 2.1.4 PCR 扩增引物
  • 2.1.5 培养基
  • 2.1.6 仪器与设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 碱法少量提取质粒 DNA
  • 2.2.2 农杆菌 EHA105 感受态细胞的制备
  • 2.2.3 液氮冻融法转化农杆菌 EHA105
  • 2.2.4 农杆菌转化子的检测时机
  • 2.2.5 杉木茎段遗传转化方法
  • r 芽的影响'>2.2.6 Km 添加的时机与方式对产生 Kmr芽的影响
  • 2.2.7 关于稳定表达的指标的探讨
  • r 芽的分子检测'>2.2.8 Kmr芽的分子检测
  • r 芽的总 DNA 提取'>2.2.8.1 Kmr 芽的总 DNA 提取
  • 2.2.8.2 PCR 检测
  • 3. 实验结果与分析
  • 3.1 提取质粒pBin35SGAFP 并转化农杆菌 EHA105
  • 3.2 AS 对转化的影响
  • 3.2.1 AS 浓度对茎段分化率的影响
  • 3.2.2 AS 对菌体的影响
  • 3.2.3 各个 AS 浓度下茎段材料选取方式不同对其分化率的影响
  • 3.2.3.1 “茎尖”与“茎段”型外植体分化率的比较
  • 3.2.3.2 “茎尖”与“茎段”型外植体褐化率的比较
  • 3.2.4 各个 AS 浓度下暗培养对茎段分化的影响
  • 3.2.4.1 培养方式对茎段分化率的影响
  • 3.2.4.2 培养方式对茎段状态的影响
  • r芽的获得'>3.3 Kmr芽的获得
  • 4. 总结与讨论
  • 第五章 主要结论和进一步研究的展望
  • 1. 主要结论
  • 1.1 转基因受体系统的建立
  • 1.2 瞬时表达实验
  • 1.3 稳定表达实验
  • 2. 存在问题及进一步研究的展望
  • 参考文献
  • 相关论文文献

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