β-榄香烯乳对肝癌Hep3B细胞的生长抑制和作用机制初探

论文摘要

β-榄香烯是我国自行研制的二类抗癌新药,它是从温莪术中提取的主要有效成分。基础研究和临床应用证实,β-榄香烯是一种广谱抗肿瘤药物,具有高效低毒、增强免疫等独特的优势。本实验室前期研究显示,β-榄香烯乳剂注射液能够抑制多种肿瘤细胞的生长,其中对人肝癌Hep3B细胞最为敏感。在本文中,较为系统的考察了β-榄香烯乳对Hep3B细胞的抗肿瘤活性,并初步研究了其诱导凋亡的作用机制,以期为β-榄香烯的临床合理应用提供依据。MTT法实验结果表明,β-榄香烯乳作用Hep3B细胞48 h的IC50为26.7±0.3μg/ml。选取人外周血淋巴细胞作为正常细胞、市售5-氟尿嘧啶注射液作为阳性对照药,可发现β-榄香烯乳的选择指数（效能比）SI为2.07±0.16,优于5-氟尿嘧啶注射液0.85±0.07。吖啶橙（AO）/溴化乙啶（EB）双染实验表明,β-榄香烯乳（20、30μg/ml）作用Hep3B细胞12 h,细胞胞核和胞浆浓染,部分染色质出现浓缩状态,细胞核呈颗粒状、环形或新月体状,细胞浆可见“出泡”等凋亡典型特征。DNA片断化（DNA Ladder）实验表明,β-榄香烯乳剂注射液（40μg/ml）作用Hep3B细胞18 h,出现凋亡特征的200 bp及其整数倍DNA梯状条带。流式细胞术（FCM）结合碘化丙啶（PI）单染实验表明,β-榄香烯乳（20～40μg/ml）,作用于Hep3B细胞0～48 h,随着给药浓度和时间的增加,Sub-G1期细胞含量显著增加。上述结果表明,β-榄香烯乳对Hep3B细胞成活率的影响是通过诱导细胞凋亡实现的。采用流式细胞术（FCM）考察β-榄香烯乳对Hep3B细胞线粒体膜电位（MMP）和细胞内活性氧（ROS）含量的影响,结果表明,β-榄香烯乳（20、40μg/ml）作用Hep3B细胞12、24 h,能显著降低细胞线粒体膜电位;β-榄香烯乳（20、40μg/ml）作用Hep3B细胞12 h,能显著增加细胞内活性氧含量。RT-PCR实验结果表明,β-榄香烯乳（20、40μg/ml）作用于Hep3B细胞12及24 h,显著增加pro-Caspase3的mRNA含量。综上所述,β-榄香烯乳剂注射液能够显著抑制Hep3B细胞的生长,并浓度、时间依赖的诱导肝癌Hep3B细胞凋亡,其诱导凋亡的机制可能与增加细胞内活性氧（ROS）聚积、降低线粒体膜电位（MMP）、上调pro-Caspase3转录水平有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 引子
• 2 β-榄香烯简介
• 3 细胞凋亡
• 4 立题依据
• 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 细胞存活率的检验
• 2.2.1 MTT法
• 2.2.2 平板集落形成法
• 2.3 单细胞凝胶电泳实验
• 2.4 荧光显微镜结合AO/EB双染考察细胞形态学变化
• 2.5 DNA片断化实验（DNA ladder）
• 2.6 流式细胞仪（FCM）考察细胞周期及凋亡率
• 2.7 流式细胞仪（FCM）考察细胞线粒体膜电位变化
• 2.8 流式细胞仪（FCM）考察细胞内活性氧含量变化
• 2.9 RT-PCR考察细胞Bcl-2、pro-Caspase3转录水平含量变化
• 3 数据统计
• 实验结果
• 1 β-榄香烯乳对Hep3B细胞的生长抑制作用
• 1.1 空白乳剂对Hep3B细胞的生长影响作用
• 1.2 β-榄香烯乳对Hep3B细胞的生长抑制作用
• 1.3 5-氟尿嘧啶注射液对Hep3B细胞的生长抑制作用
• 1.4 β-榄香烯乳和5-Fu对正常细胞的生长抑制作用
• 1.5 β-榄香烯乳和5-Fu的选择指数比较
• 1.6 CF考察β-榄香烯乳和5-Fu对Hep3B细胞的生长抑制作用
• 2 β-榄香烯乳对肝癌Hep3B细胞的诱导凋亡作用研究
• 2.1 β-榄香烯乳对Hep3B细胞的作用方式初探
• 2.1.1 倒置光镜下观察β-榄香烯乳对Hep3B细胞的形态学影响
• 2.1.2 单细胞凝胶电泳考察β-榄香烯乳对Hep3B细胞DNA损伤及其修复影响
• 2.2 β-榄香烯乳对Hep3B细胞的诱导凋亡作用研究
• 2.2.1 荧光显微镜下观察β-榄香烯乳对Hep3B细胞的形态学影响
• 2.2.2 DNA片段化实验（DNA ladder）检测β-榄香烯乳对Hep3B细胞的诱导凋亡作用
• 2.2.3 流式细胞术（FCM）考察β-榄香烯乳对Hep3B细胞凋亡率及细胞周期的影响
• 3 β-榄香烯乳对肝癌Hep3B细胞诱导凋亡作用机制的初步研究
• 3.1 β-榄香烯乳对Hep3B细胞线粒体膜电位影响
• 3.2 β-榄香烯乳对Hep3B细胞内活性氧含量影响
• 3.3 β-榄香烯乳对Hep3B细胞mRNA水平Bcl-2、pro-Caspase3的影响
• 实验讨论
• 一. β-榄香烯乳剂注射液的体外抗肿瘤活性
• 二. β-榄香烯乳剂注射液对Hep3B细胞的诱导凋亡作用
• 三. β-榄香烯乳剂注射液的诱导凋亡作用机制初探
• 实验结论
• 参考文献
• 致谢