大鼠脑小胶质细胞对次声的反应

论文摘要

次声（infrasound）是由物体（物质）的机械性振动所产生,频率为0.0001～20Hz的声波。次声广泛存在于我们的环境中,凡有噪声的地方,都可能存在次声。这些低频噪声除污染环境并危害着人们的健康外,次声武器作为一种新技术武器已经开始研究并装备到部队。此外次声对人类也有许多益处:可以利用次声观测火山、海啸、地震等自然灾难进行提前报警,还可以用次声诊断和治疗疾病。小胶质细胞（microglia MI）作为中枢神经系统常驻的免疫细胞一方面保护中枢神经系统免受外来微生物的侵入,清除不需要的碎片,另一方面产生细胞因子以及与免疫系统联系。活化的MI可以参与中枢神经系统急性损伤、卒中、炎性以及神经变性性疾病的发病过程。一定强度的次声噪音和次声武器作用于人体后可产生多种危害,可以引起机体行为学、形态学、蛋白结构、基因分子等多方面的改变。一些研究表明次声声级水平愈高,损伤愈严重。而小胶质细胞在神经组织的损伤以及炎性反应的发生、发展过程中发挥着重要的作用。以往文献报道次声作用后可以引起神经元损伤、星形胶质细胞的活化,但有关脑内小胶质细胞是否对次声刺激起反应,小胶质细胞形态上有何改变以及时间过程如何,目前均未见到报道。因此,研究次声作用后小胶质细胞的变化对了解次声性脑损害机制和脑保护的研究具有十分重要的理论和实用价值。本实验进行了2个实验:实验一:将成年SD雄性大鼠反复暴露于声压级16Hz 130dB的次声环境中。在次声作用后不同时间点处死大鼠,对脑组织进行免疫组织化学染色,扫描电镜和透射电镜观察。观察在体:次声作用后即刻,12h,1d, 7d,14d大鼠海马、下丘脑室旁核小胶质细胞的变化情况及其与中枢神经系统中其他细胞间关系变化;次声作用后即刻,1d, 7d,扫描电镜和透射电镜下脑组织超微结构的变化。结果表明:（1）光镜下:正常大鼠小胶质细胞数量较少,一般为静息状态（静息型）,与其他细胞无特别联系。次声作用后即刻大鼠小胶质细胞开始被活化、增殖,表现为光镜下:0X42阳性细胞深染,胞体变大变圆,突起变短、变粗长、变少,呈肥大型或阿米巴型小胶质细胞,并且还可以看出小胶质细胞数量显著增多（P〈0.01）,这种变化在7d以后逐渐减弱。次声作用后第7d起星形胶质细胞变多,胞体变大,突起变粗,染色深,第14d达到高潮;小胶质细胞和星形胶质细胞之间的关系密切:次声作用后第7d可见到小胶质细胞与星形胶质细胞间有双标记橙黄色突起,这些突起数量在第14d达到高潮。此外还可见正常对照组小胶质细胞分布无特定规律,而活化的小胶质细胞主要分布与神经元周围。（2）电镜下:可见正常大鼠小胶质细胞数量较小,较少,次声作用后1d小胶质细胞细胞核变大,突起增多,细胞内结构变丰富可见其内有吞噬小泡和溶酶体颗粒。活化的小胶质细胞主要分布于神经元、毛细血管周围,有的包绕神经元。在次声连续作用7d以后小胶质细胞数量较次声作用1d减少,但仍表现为活化状态。此外次声作用后还可发现从毛细血管内游走出的小胶质细胞。实验二:将体外培养小胶质细胞暴露于次声环境中30min,1h,而后采用免疫细胞化学法和Luminex液相芯片法观察不同时间点（0h,4h,12h,24h）小胶质细胞的变化以及其细胞因子分泌的变化情况。结果表明:（1）细胞形态的改变:可见正常对照组与保温箱对照组小胶质细胞表现为细胞胞体较小,为圆形或扁平细胞,拥有短的突起或是没有突起,细胞胞膜光滑,细胞内无吞噬小泡的阿米巴样小胶质细胞或是其前体细胞。荧光染色可见均匀一致的小而圆的红色细胞。次声作用30min后即刻小胶质细胞就开始发生改变,相差显微镜下可见细胞胞体肿胀、折光不均。在次声作用后12h,可见细胞肿胀更明显,细胞形态不规则,细胞膜上出现囊泡状物质,细胞边缘可见毛刺状突起;荧光显微镜下可见细胞荧光强度加大,CD11b主要表达于细胞膜;此外还可发现双核细胞比率显著增多（45%±5%）,并且可见许多小的OX42阳性细胞,提示小胶质细胞存在细胞增殖、分裂。而到次声作用后24h,小胶质细胞内空泡增多,细胞内也可见一些吞噬小泡,细胞形态更加不规则考虑为过渡活化所致。此时仍可见许多双核细胞,同时可发现小的阳性细胞比率增加。在次声作用1h与30min相比变化规律相同,不同的是细胞活化更强烈,但在1h组双核细胞较30min组少（20%±8%）。在次声作用1h后24h,细胞状态变差,大体积的阿米巴样MI变少,有部分细胞坏死;可见部分分枝状小胶质细胞,拥有两个或是多个自胞体发出的长突起,成分枝状,且突起长与细胞胞体直径。（2）细胞因子的变化:我们用液相芯片技术检测了小胶质细胞培养上清液中4种细胞因子的含量,发现次声可以引起小胶质细胞细胞培养液中细胞因子TNF-α, IL-1β, IL-10and IL-18的增加。在次声作用30min后即刻IL-10就开始升高,到12h达到高峰. TNF-α和IL-1β的表达则是在次声作用后12h升高至峰值,然后降低。细胞因子IL18则除次声作用后即刻含量有所减低外,随后含量呈持续性升高在24h达到高峰。INF-γ可以抑制小胶质细胞分泌这些因子,各组小胶质细胞上清液中均没有检测出INF-γ的分泌。在次声作用1h后,小胶质细胞细胞培养液中炎性因子TNF-α与IL1-β含量虽呈持续性升高;IL-18在次声作用后即刻增高之后逐渐下降;而保护性因子IL-10在4h和24h出现双峰值,并且各观察点数值与对照组相比增高。此外,免疫细胞染色发现,细胞内TGF-β的表达在30min次声作用后呈持续增高趋势而在1h次声作用后呈持续降低趋势。本实验结论如下:（1）大鼠暴露于16Hz 130dB次声后,脑内小胶质细胞活化,并且这种反应较星形胶质细胞的反应早。（2）次声引起的活化的小胶质细胞一方面主要分布于神经元、毛细血管周围,另一方面可与星形胶质细胞发生密切联系。（3）次声同样可以引起体外培养的小细胞活化。次声暴露30min后,小胶质细胞主要分泌保护性细胞因子,而暴露1h后小胶质细胞主要分泌炎性细胞因子。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 成年大鼠海马齿状回、下丘脑室旁核小胶质细胞对次声的反应
• 前言
• 材料与方法
• 1. 动物分组与模型制作
• 2. 免疫组织化学染色
• 3. 结果观察和图象采集
• 4. 电镜组
• 结果
• 1. 小胶质细胞的反应
• 2. 星形胶质细胞的反应
• 3. 神经元的反应
• 4. 毛细血管的变化
• 5. 小胶质细胞与星形胶质细胞的关系
• 6. 小胶质细胞与神经元的关系
• 7. 小胶质细胞与毛细血管的关系
• 讨论
• 实验二 体外培养小胶质细胞对次声的反应
• 前言
• 材料与方法
• 1. 培养皿的处理
• 2. 原代小胶质细胞的培养、纯化与鉴定
• 3. 实验分组与模型制作
• 4. 三重免疫荧光染色
• 5. 细胞培养上清液内细胞因子的检测
• 6. 结果观察和图象采集
• 结果
• 1. 小胶质细胞的纯度鉴定
• 2. 小胶质细胞的形态变化
• 3. 小胶质细胞内细胞因子的变化
• 4. 小胶质细胞培养液中细胞因子含量的变化
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 在读期间发表论文情况
• 致谢