胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢关键因子的筛选及DHEA的调控研究

论文摘要

本文以脂肪型AA肉鸡和瘦肉型三黄肉鸡为实验对象,以比较蛋白组学为主要研究手段,揭示其在胚胎发育过程中肝脏蛋白组的表达谱,并在差异比较的基础上,筛选出了影响两种肉鸡脂类代谢的关键蛋白和酶;接着利用生理调节剂——脱氢表雄酮（DHEA）在孵化前导入AA肉鸡种蛋,探索其对胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢的影响;并结合构建肝脏蛋白质的酪氨酸磷酸化修饰谱,更加深入地揭示DHEA调控肉鸡脂类代谢的机制。1胚胎期肉鸡肝脏蛋白质表达谱的发育性变化鸡胚是脊椎动物胚体发育研究的主要模式材料,在发育生物学中具有较高的地位。肝脏在鸡胚生长发育过程中具有重要的作用,尤其是在糖代谢、脂代谢、胆汁酸的产生及造血器官的形成中发挥重大作用.本实验以生长速度快,腹部脂肪沉积较多的Arbor Acres肉鸡（简称AA肉鸡）和生长速度慢,脂肪沉积较少的三黄肉鸡（简称SH肉鸡）为实验动物,从蛋白水平探索肉鸡胚肝发育相关蛋白质的动态变化,为深入研究鸡胚肝脏的发育奠定基础。分别取9、14、19胚龄和出壳时的肝脏,经2D-PAGE分离后,对经胶体考马斯亮蓝G-250染色的图像用PDquest7.3软件进行差示分析,取差异表达的蛋白质点进行胶内酶切和MALDI-TOF-MS分析,肽指纹图谱数据检索NCBInr蛋白质数据库进行差异表达蛋白质的身份鉴定。在AA鸡和三黄鸡胚肝发育蛋白谱中,分别发现32和25个表达水平具有显著性差异变化的蛋白质点,其中26个和21个得到了鉴定。在这些被鉴定的蛋白中,大多涉及到机体内基础代谢的酶、细胞生长分化、胚胎形成及信号传导等,尤其是不同形式的硫酸基转移酶同工酶的表达呈明显的发育性变化,提示其与肉鸡胚胎的正常生长发育和肝脏功能密切相关.2两种肉鸡胚胎期肝脏脂类代谢相关蛋白表达的差异比较挑选40周龄体况良好的产蛋的脂肪型AA肉鸡和瘦肉型SH肉鸡,饲喂AA肉种鸡日粮,散养。收集种蛋孵化,分别取9、14、19胚龄和出壳时的肝脏.经2D-PAGE分离及MALDI-TOF-MS分析,确定了其中37个蛋白点的身份.结果表明,脂肪型AA肉鸡胚重、肝重均显著大于瘦肉型SH肉鸡。此外,机体内重要代谢的关键因子如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、载脂蛋白A-I、脂肪酸结合蛋白、HMGCoA合成酶及硫酸基转移酶,其表达存在明显的品种差异。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、载脂蛋白A-I、脂肪酸结合蛋白、HMGCoA合成酶在瘦肉型的三黄肉鸡上调表达;提示瘦肉型三黄肉鸡的糖异生作用、胆固醇代谢及脂肪酸氧化能力均强于脂肪型AA肉鸡,因而脂肪沉积减少.结果表明胚胎期肉鸡脂类代谢相关蛋白和酶的表达存在品种差异。3 DHEA对胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢相关蛋白表达的影响DHEA是动物体内包括禽类的类固醇激素的前体.挑选蛋重相近的AA肉鸡种蛋,随机分为两组,实验组按50mg/kg蛋重导入DHEA,其溶解于50μL DMSO溶剂中,对照组则导入50μL溶剂.分别取9、14、19胚龄和刚出壳时的肝脏.经2D-PAGE分离及MALDI-TOF-MS分析,确定了其中37个蛋白点的身份。结果表明,DHEA显著降低胚胎中后期肉鸡胚重和绝对肝重。DHEA上调肝脏载脂蛋白A-I的表达,促进胆固醇转变成胆固醇酯;上调具有抗氧化作用的肝硫氧还蛋白过氧化物酶6的表达;上调肝脏硫酸基转移酶（pH5.9）的表达以促进其底物DHEA本身的生物转化;尤其重要的是,DHEA下调肝脏糖代谢中重要关键酶——丙酮酸脱氢酶的表达,减少肝细胞中合成脂肪酸的前体分子乙酰辅酶A的数量,从而有效降低肝脏脂肪的合成和转出。结果提示,DHEA可能通过对其自身的靶酶发生影响实现降脂功能.4 DHEA对胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢相关磷酸化的研究挑选蛋重相近的AA肉鸡种蛋,随机分为两组,实验组按50mg/kg蛋重导入DHEA,其溶解于50μL DMSO溶剂中,对照组则导入50μL溶剂。分别取9、14、19胚龄和刚出壳时的肝脏.经2D-PAGE分离并结合磷酸化氨基酸抗体检测及MALDI-TOF-MS分析,确定了其中32个磷酸化蛋白点的身份,其中的22个蛋白点的磷酸化状态或磷酸化信号强度明显受DHEA的影响。结果表明,DHEA作为物质代谢调节的信号分子,通过对其自身靶酶的磷酸化/去磷酸化作用进行调节以影响其活性;DHEA增强肝脏硫氧还蛋白过氧化物酶6的磷酸化水平以提增该酶的抗氧化活性;通过提高硫酸基转移酶（pH5.9）磷酸化程度促进DHEA在肝脏中的生物转化;更重要的是揭示了DHEA减少肝脏中乙酰辅酶A的生成机制,即在下调肝脏丙酮酸脱氢酶的表达的同时增强其磷酸化程度,从而减少从糖的分解代谢向脂肪合成代谢提供乙酰辅酶A原料,进而减少脂肪的合成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 脂类代谢及其调控机理研究进展
• 1 脂肪代谢的基本过程
• 2 脂肪沉积的组织特点
• 3 脂肪代谢调控研究进展
• 4 禽类脂类代谢及其调控研究进展
• 第二章 生理调节剂 DHEA的研究进展
• 1 DHEA的合成、代谢与分布
• 2 DHEA的生物学功能
• 3 DHEA作用机理研究
• 第三章 蛋白质组学及其研究技术
• 1 蛋白质组学产生的背景
• 2 蛋白质组学的一般概念
• 3 蛋白质组学研究技术及其发展
• 4 磷酸化蛋白质分离检测技术
• 5 蛋白质组学在动物科学中的应用
• 6 蛋白质组学的研究趋势与展望
• 第二篇 实验研究
• 第四章 胚胎期肉鸡肝脏蛋白质表达谱的发育性变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 第五章 两种肉鸡胚胎期肝脏脂类代谢相关蛋白表达的差异比较
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 第六章 DHEA对胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢相关蛋白表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 第七章 DHEA对胚胎期肉鸡肝脏脂类代谢相关蛋白磷酸化的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 总体讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 本论文创新点
• 博士期间论文发表
• 致谢
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ