论文摘要
第一部分肺炎衣原体感染巨噬细胞对NF-кB通路激活的影响目的：以THP-1（人急性白血病单核细胞）源性巨噬细胞为研究对象观察肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, C.pn）感染对核因子-кB （NF-кB）通路激活的影响。方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24～48小时,倒置显微镜下观察,见其分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）阴性对照组：予以含有50μg/mL低密度脂蛋白（LDL）的培养基孵育48h；（2）阳性对照组：予以含有50μg/mL氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的培养基孵育48h；（3）C.pn感染浓度组：在予以50μg/mL LDL孵育条件下,分别给予1×105、4×105、5×105、1×106IFU C.pn感染48h；（4）C.pn感染时间组：在予以50μg/mL LDL孵育条件下,给予1×106IFU C.pn分别感染24h、48h、72h。用凝胶电泳迁移法（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测C.pn感染对NF-кB通路激活的影响。结果：阴性对照组的NF-кB通路未见激活,阳性对照组、C.pn感染浓度组和C.pn感染时间组的NF-кB通路有明显激活。NF-кB的活性随C.pn感染浓度的增大而增加。相同剂量的C.pn感染,在感染24h时对NF-кB的激活达到最大效应,随着感染时间的延长,在48h和72h时,NF-кB的活性逐渐下降。结论：在负荷LDL的情况下,C.pn感染可呈浓度依赖性地激活NF-кB通路,且在感染24h时有最大的激活效应,为我们进一步研究NF-кB在C.pn感染介导动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了理论基础。第二部分NF-кB信号通路在肺炎衣原体诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化中的作用目的：以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,利用RNA干扰基因沉默（RNAi）技术沉默NF-кB P65基因表达以抑制NF-кB的活性后,观察NF-кB活性抑制在C.pn感染诱导巨噬细胞向泡沫细胞转化中的作用。方法：首先针对NF-кB基因的P65亚基,将人工设计合成的一组荧光标记的阴性对照序列、一组普通阴性对照（negative control siRNA）序列和3组NF-кB P65siRNA （NF-кB P65siRNA1-3）序列分别转染入细胞,使用荧光显微镜观察法直接观察荧光标记的阴性对照序列的转染效率,使用Real Time-PCR （RT-PCR）和western blot检测NF-кB P65mRNA和蛋白的表达,筛选出抑制效率高的序列。随之,用negative control siRNA和筛选出的高效NF-кB P65siRNA序列分别转染巨噬细胞24h,在予以50μg/mL LDL孵育条件下给予C.pn感染32h,用油红O染色法观察巨噬细胞胞浆内脂滴的变化并计数各组的泡沫细胞数量。结果：在荧光显微镜下可见转染入细胞内siRNA呈绿色荧光,荧光细胞的百分率即代表转染效率,转染效率为83.33%±2.52。与普通阴性对照组相比,三组NF-кB P65siRNA转染巨噬细胞后,NF-кB P65mRNA和蛋白表达都有下调,其中NF-кB P65siRNAl和NF-кB P65siRNA3对靶基因的抑制效果佳。在转染NF-кB P65siRNA后,感染C.pn的巨噬细胞胞浆内脂滴的数目及体积明显减少、所形成的的泡沫细胞数目亦明显减少。结论：干扰序列的转染效率高,NF-кB P65siRNA1和siRNA3转染后能明显抑制巨噬细胞内NF-кB P65的表达.NF-кB基因沉默可使C.pn感染诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞的形成减少。第三部分NF-кB信号通路在肺炎衣原体诱导巨噬细胞泡沫化中对胆固醇代谢关键基因的调控作用目的：观察NF-кB信号通路在C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化中对胆固醇代谢关键基因酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）、 ATP结合盒转运子A1/G1（ABCA1/G1）、 Al型清道夫受体（SR-A1）的调控作用。方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24～48小时,倒置显微镜下观察,见其分化为巨噬细胞后,随机分为3组：（1） negative control siRNA组：negative control siRNA转染细胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFU C.pn感染32h；（2）P65siRNA1组：NF-кB P65siRNAl转染细胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h;（3）P65siRNA3组：NF-кB P65siRNA3转染细胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFU C.pn感染32h。运用分别运用RT-PCR和Western blot检测ACATl ABCA1/G1、 SR-A1mRNA和蛋白的表达。结果：与negative control siRNA组相比,NF-кB P65基因沉默后,再予以C.pn感染可致ACATl、 ABCA1/G1mRNA和蛋白表达明显下调,SR-A1mRNA和蛋白表达大体趋势上无明显改变。提示C.pn感染诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成,与NF-кB信号通路对巨噬细胞内胆固醇代谢关键基因ACATl、 ABCA1/G l、 SR-Al的调控有关。结论：NF-кB通路在肺炎衣原体诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化的过程中,可通过调控胆固醇代谢关键基因的表达而影响胆固醇代谢的稳态,这可能是肺炎衣原体介导巨噬细胞向泡沫细胞转化的机制之一。第四部分NF-кB和PPAR a/y信号通路在肺炎衣原体感染诱导巨噬细胞泡沫化中的交互作用目的：观察NF-кB和PPAR α/γ信号通路在C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化中的交互作用。方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24～48小时,倒置显微镜下观察,见其分化为巨噬细胞后,分别进行下述两部分实验,皆随机分为三组。观察NF-кB活性抑制对PPARα/y的影响（1） negative control siRNA组：negative siRNA转染细胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h;（2） P65siRNAl组：NF-кB P65siRNAl转染细胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h；（3）P65siRNA3组：NF－kB P65siRNA3转染细胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h。运用RT-PCR和Western blot检测PPARα、 PPAR y mRNA和蛋白的表达,观察PPARα/y的激活改变对NF-κB的影响（1）阴性对照组：在予以50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h；（2）非诺贝特组：予以20μM/L PPAR a的激动剂非诺贝特预孵育2h后,在给予50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h；（3）罗格列酮组：予以20μM/LPPARγ的激动剂罗格列酮预孵育2h后,在给予50μg/mL LDL孵育条件下,用1×106IFUC.pn感染32h。运用凝胶电泳迁移法检测各组NF-кB的活性。结果：与negative control siRNA组相比,P65siRNAl组和P65siRNA3组PPAR a, PPAR y mRNA和蛋白表达显著增加,提示C.pn感染可通过NF-кB通路调节PPARα/y基因的表达；与单纯的C.pn感染组相比,非诺贝特和罗格列酮预处理皆明显抑制了NF-кB的激活,提示C.pn感染可通过PPARα/y通路影响NF-кB的活性。结论：NF-кB和PPAR a/y信号通路在C.pn感染诱导巨噬细胞泡沫化的过程中可交互作用,它们相互影响共同参与调控胆固醇代谢关键基因的表达,从而影响胆固醇代谢的稳态和泡沫细胞的形成。这可能为我们进一步探讨C.pn感染促进动脉粥样硬化的发病机制及其治疗靶点提供新的理论依据。