皱纹盘鲍热休克蛋白70基因的克隆、表达及应用

论文摘要

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员,它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能,它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。采用RACE方法从皱纹盘鲍中克隆到一种HSP70基因的全长cDNA序列,该序列与其它物种的HSP70基因高度同源。克隆得到的皱纹盘鲍HSP70基因的全长cDNA序列为2631bp,开放阅读框为1968bp,另外其5’-和3’-非翻译区长度分别是90和573bp,其中3’-非翻译区具有AATAAA mRNA加尾信号及PolyA寡聚腺苷酸。开放阅读框编码655个氨基酸,包含N端包含的382个氨基酸的ATP酶结合域（约45kDa）、由161个氨基酸编码的底物肽结合结构域（18kDa）及112个氨基酸编码的C端结构域（10kDa）。构建了含有皱纹盘鲍HSP70的表达载体,以期得到体外表达的重组热激蛋白70,为制备抗体,通过Western blot杂交或酶联免疫等方法检测HSPs蛋白表达情况作准备。为了研究皱纹盘鲍HSP70的转录表达,采用半定量RT-PCR方法,对HSP70不同组织及热休克、鳗弧菌感染下的转录表达情况分析。试验结果表明,采用热应激及鳗弧菌处理皱纹盘鲍,均能导致皱纹盘鲍肌肉中HSP70 mRNA转录水平明显增加,并在处理后96 h恢复至正常水平;与肌肉组织不同的是,鳃组织在温度及鳗弧菌处理后12 h后达到最高值,并一直维持相对较高的表达水平。在温度和鳗弧菌处理下,皱纹盘鲍HSP70上调表达表明HSP70的响应没有胁迫特异性,可能参与了皱纹盘鲍的免疫反应。以皱纹盘鲍近交和杂交群体为材料,研究了不同群体的生长速率和HSP70的表达量的差异。试验结果表明,在较低的处理温度下,皱纹盘鲍近交群体HSP70的表达量高于杂交群体,随着处理温度的升高,在接近致死温度时,杂交群体的HSP70表达量要高于近交群体;不同群体达到最大HSP70表达量时的温度(Tpeak)也不同,近交群体的Tpeak为26℃,低于杂交群体（28℃）;近交群体的最大HSP70表达量高于杂交群体。以上试验结果表明杂交群体的HSP70的表达变化幅度较近交群体的变化幅度小,具有更宽的温度适应性。可能提供了关于杂交能够缓解皱纹盘鲍内在遗传压力的证据。用荧光定量PCR方法分析不同壳色皱纹盘鲍在热激胁迫下不同恢复时间和

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 第一节 热休克蛋白的研究进展及应用
• 1. 热休克蛋白的研究历史
• 2. 热休克蛋白的分类
• 3. 热休克蛋白的分布
• 4. 热休克蛋白的分子结构特征
• 4.1 HSP90 家族的分子结构
• 4.2 HSP70 家族的分子结构
• 4.3 HSP60 家族的分子结构
• 4.4 小分子HSPS 家族的分子结构
• 5. HSPS 的辅助蛋白
• 5.1 HSP90 家族的辅助蛋白
• 5.2 HSP70 家族的辅助蛋白
• 5.3 HSP60 家族的辅助蛋白
• 6. 热休克蛋白基因及其调控
• 6.1 热休克基因的转录调控
• 6.2 转录后水平（翻译水平）的调控
• 6.3 热休克基因的特异表达调控
• 6.4 热休克基因不寻常的剪切
• 7 热激信号的传导
• 7.1 HSPS 诱导因子
• 7.2 热激信号传导途径
• 8. 热休克蛋白的生物学功能
• 8.1 充当分子伴侣
• 8.2 使生物获得耐热性
• 8.3 调控细胞骨架动力学
• 8.4 抗氧化作用
• 8.5 参与免疫应答
• 8.6 调节细胞凋亡
• 9 HSPS 的研究意义
• 9.1 HSPS 与衰老的研究
• 9.2 HSPS 与生物进化的研究
• 9.3 HSPS 与生物标记（BIOMARKER）
• 9.4 HSPS 与肿瘤的治疗
• 第二节 水生生物HSPS 研究进展
• 1. 贝类HSP 的研究进展
• 2. 其他水生生物HSP 的研究进展
• 3. 分离贝类免疫相关基因的方法
• 3.1 图位克隆技术
• 3.2 简并PCR 技术
• 3.3 差异表达基因分离技术
• 3.4 转座子标签技术
• 3.5 序列表达标签法
• 3.6 RACE-PCR 技术
• 4. 基因表达常规分析方法
• 4.1 NORTHERN 印迹
• 4.2 核糖核酸酶保护实验
• 4.3 半定量RT-PCR 法
• 4.4 实时荧光定量PCR（REAL-TIME FLUORESCENT QUANTITATIVE PCR）
• 4.5 基因表达序列分析（SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION, SAGE）
• 4.6 微阵列法
• 第三节 本论文的研究目的及意义
• 第二章 编码皱纹盘鲍一种HSP70 的CDNA 克隆及其序列分析
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试验方法
• 3. 结果
• 3.1 RNA 提取
• 3.2 皱纹盘鲍热休克蛋白70 基因中间片段扩增
• 3.3 HSP70 全长CDNA 的克隆
• 3.4 皱纹盘鲍HSP70 基因的氨基酸序列分析
• 3.5 HSP70 基因的二级结构分析
• 3.6 HSP70 基因的空间结构预测
• 3.7 HSP70 基因的同源性分析
• 3.8 表达载体的构建
• 4. 讨论
• 第三章 皱纹盘鲍HSP70MRNA 表达水平的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果
• 3.1 皱纹盘鲍HSP70 基因的组织特异性表达
• 3.2 用RT-PCR 检测热诱导下HSP70 基因表达
• 3.3 用RT-PCR 检测鳗弧菌（VIBRIO ANGUILLARUM）感染后HSP70 基因表达
• 4. 讨论
• 第四章 四个人工选育皱纹盘鲍群体HSP70 的表达分析
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3. 结果
• 3.1 生长速率
• 3.2 HSP70 片段序列分析
• 3.3 不同群体皱纹盘鲍HSP70 转录表达变化
• 3.4 生长速率与HSP70 表达量的相关性
• 4. 讨论
• 第五章 荧光定量PCR 检测皱纹盘鲍HSP70 的表达
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果
• 3.1 标准曲线的制作
• 3.2 用REAL-TIME PCR 检测热诱导下皱纹盘鲍肌肉组织中HSP70 基因表达
• 3.3 不同壳色越冬后皱纹盘鲍在温度胁迫下的HSP70 REAL-TIME PCR 分析
• 4. 讨论
• 4.1 标准曲线的建立
• 4.2 体系的确立
• 4.3 产物特异性,引物二聚体和检测灵敏度
• 4.4 HSPS 实时定量检测
• 4.5 RT-PCR 半定量检测和REAL-TIME PCR 的结果比较
• 4.6 皱纹盘鲍南方越冬后HSP70 的表达量分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢