论文摘要
松茸是与Tricholoma matsutake相近的一些口蘑属近缘种的总称，在分类上均属于担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataoeae），口蘑属（Tricholoma），是世界上珍稀名贵的外生菌根菌。主要分布在亚洲地区，美洲、欧洲和北非部分地区也有生长，与松属和栎属植物形成共生关系。不同地区、不同宿主的松茸经过长期系统演化，可能发生遗传特性上的差异。目前，关于松茸的研究多停留在一般分类鉴定、人工栽培、生态管理等方面，对于世界不同分布地区、不同宿主的松茸液体培养和遗传特性的研究较少。松茸这种世界公认的名贵食用菌，尚不能人工栽培，而且野生资源正在急剧减少，因此，有必要进一步开展液体培养，研究松茸资源的遗传背景，对提升我国特殊生物资源替代产品的开发利用和规模化生产的整体技术水平、培育资源节约型生物新产业具有重要作用。本试验以中国、日本、美国、瑞典、北非等松茸主要分布区域的不同宿主的松茸为供试菌株，对菌丝生长特性、酯酶同工酶特性和线粒体DNA（mtDNA）-MS序列进行系统研究，筛选出适宜液体培养的优良菌株并提出配套的培养条件，探索酯酶同工酶电泳和mtDNA-PCR扩增的适宜条件，比较不同生境松茸菌株的遗传差异，为松茸这种特殊生物资源的替代产品研发及规模化生产奠定基础，填补这方面研究的空白。试验结果表明，不同分布区域、不同宿主的松茸菌株遗传差异性很大。结果如下：（1）按菌落形态特征不同，供试菌株分为两类：第一类为亚洲松茸Tricholoma matsutake，包括以日本赤松、日本黑松、日本铁杉、日本栎树和瑞典赤松为宿主的供试菌株L89-2、L89-3、91035、Old cap、Y-N-05、240625、240621、240201和Eric；第二类为美洲松茸T. magnivelare和北非松茸T. caligatum，包括以美国针叶林、美国海岸松和北非雪松为宿主的菌株Am-3、Am-20和241803。（2）根据液体培养菌丝生长速率的方差分析结果和菌球形成的优良，筛选出2个最适宜液体培养的供试菌株，分别为以美国海岸松和日本铁杉为宿主的Am-20和240621。（3）明确了液体培养的适宜条件：1000ml蒸馏水加入葡萄糖20g、蛋白胨1g、酵母1g，pH值5.2～5.3，转速180r／min、培养温度24℃。（4）提出了酯酶同工酶电泳的适宜条件：分离胶浓度7.0％，浓缩胶浓度2.5％，分离胶电压200V，浓缩胶电压140V，电泳3.5h。（5）MtDNA-PCR扩增的适宜条件因区域不同而异。中国以赤松为宿主的5个松茸菌株PCR扩增的适宜参数：MgCl21μl，一对MS引物各1μl；循环参数为：94℃变性30S，55℃复性30S。以日本赤松、日本黑松、日本栎树、美国针叶林、美国海岸松和北非雪松为宿主的7个供试菌株的PCR扩增的适宜参数：MgCl21.5μl，一对MS引物各1.5μl；循环参数为：94℃变性50S，55℃复性50S。（6）NTSYS软件分析酯酶同工酶电泳结果，构建系统树，将供试菌株分为三类：第一类，与菌落形态特征分析的结果相同；第二类，为美洲松茸T. magnivelare，包括以美国针叶林和美国海岸松为宿主的供试菌株Am-3和Am-20；第三类，为北非松茸T. caligatum，仅包括以北非雪松为宿主的供试菌株241803。（7）按照mtDNA-MS序列的分析结果，不同分布区域、不同宿主的松茸菌株遗传背景不同：美洲的松茸有明显的宿主差异；亚洲的松茸和欧洲的松茸MS序列具有高度同源性；北非的松茸与亚洲、美洲和欧洲的松茸有明显的遗传差异。