导读:本文包含了疏水性电荷诱导层析论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:疏水性电荷诱导层析,等温滴定量热法,免疫球蛋白G,白蛋白
疏水性电荷诱导层析论文文献综述
袁晓明[1]（2018）在《疏水性电荷诱导层析介质的吸附性能和作用机制研究》一文中研究指出抗体是重要的生物药物和免疫诊断试剂,具有巨大的市场需求。基于蛋白A亲和层析的传统抗体分离方法存在成本高昂、配基泄露、洗脱条件苛刻等局限,制约了抗体产业的发展。疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)作为一种新型抗体分离方法,具有吸附容量大、选择性较高、分离条件温和、成本较低等优点,具有良好的抗体分离应用潜力,但相关机理认识需要进一步加强。本文以商业化HCIC介质MEPHyperCel和叁种新型HCIC介质(MMI、ABI和W-ABI介质)为主要研究对象,以静态吸附和等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)为主要研究手段,考察了四种HCIC介质的蛋白吸附性能,并从热力学角度揭示HCIC介质的作用机理,为分离过程优化和新型配基设计提供重要依据。首先,考察了 MEPHyperCel介质的蛋白吸附性能研究。MEPHyperCel介质对叁种抗体(hIgG、bIgG和mAb)的吸附容量均远大于两种血清白蛋白(HSA和BSA),体现出抗体分离的应用潜力。MEPHyperCel吸附具有较强的pH依赖性和一定的耐盐吸附特性。添加辛酸钠能够明显降低MEPHyperCel对BSA的吸附量,提高对IgG的选择性。实验发现,同时加入辛酸钠和一定浓度的NaCl,能够显着减少MEPHyperCel介质对BSA的吸附。温度升高也会一定程度减少BSA的吸附。在吸附实验基础上,利用ITC对辛酸钠、MEP配基和MEP介质与蛋白相互作用进行了研究。发现辛酸钠-BSA间的相互作用大于辛酸钠-IgG,且辛酸钠-BSA相互作用以疏水作用为主。加入辛酸钠同时加入一定浓度NaCl,或者升高温度,会使辛酸钠与BSA间的疏水作用增强。同时,ITC结果表明,IgG与MEP配基之间的亲和力远高于白蛋白,且MEP-IgG间同时存在疏水作用、静电作用、氢键、范德华力等多种作用力。pH变化显着影响MEP与IgG之间的静电作用和疏水作用,导致MEP HyperCel介质对hIgG的吸附容量有较大的变化。此外,ITC结果揭示了 MEPHyperCel介质耐盐吸附特性的热力学机制,即MEP配基与hIgG相互作用的过程中存在熵焓补偿现象,使得反应自由能的变化不大。其次,考察了叁种新型HCIC介质(MMI、ABI和W-ABI介质)的吸附性能研究。中性pH条件下,叁种新型HCIC介质对hIgG均有较高的吸附容量,其中含有双功能配基的W-ABI介质对hIgG的吸附力最强,ABI介质次之,MMI介质最弱。叁种介质同样体现出较明显的pH依赖性吸附特性和较好的耐盐吸附性能。相对而言,W-ABI介质的pH敏感性比另外两种介质弱。50%体积浓度的乙二醇可以较明显地降低MEP HyperCel、MMI和ABI介质的饱和吸附容量,但对W-ABI介质的吸附性能影响不大。1 M精氨酸浓度下,四种HCIC介质的吸附容量均有所减小,但整体变化幅度不大,说明精氨酸对这四种介质的蛋白解吸促进作用并不明显。最后,对新型HCIC介质-蛋白相互作用进行了 ITC研究。考察了不同pH、NaCl浓度、乙二醇浓度和精氨酸浓度下,MMI、ABI和W-ABI与hIgG之间的相互作用,并与MEP HyperCel介质进行对比。发现pH对介质-蛋白相互作用的影响显着,不同介质的NaCl影响略有不同,加入乙二醇会屏蔽介质-蛋白间的疏水作用,而精氨酸的加入则会屏蔽静电作用。中性pH条件下,MMI、ABI和W-ABI介质均通过混合作用模式实现抗体的结合。其中,MMI介质的亲硫作用和疏水作用较强,静电作用较弱;ABI介质与MEP HyperCel介质的作用机理相近,但疏水作用的贡献要大于MEP HyperCel介质;W-ABI介质与hIgG间的作用力比较强,导致W-ABI介质具有很好的耐盐吸附性能,但对pH的依赖性没有其它叁种介质高。本文以了解HCIC介质的蛋白吸附性能和作用机理为出发点,探讨了 pH、盐和特殊添加剂对吸附性能的影响,通过ITC实验探讨了 HCIC介质与抗体之间的相互作用,揭示了 HCIC介质的作用机理,为层析分离的过程优化和新型配基的设计提供重要的依据。(本文来源于《浙江大学》期刊2018-12-01）
刘韬[2]（2017）在《聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质设计及蛋白质吸附机理研究》一文中研究指出疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography,HCIC)是一种新型抗体分离技术,其配基兼有疏水、静电、氢键等多种相互作用,具有选择性好、耐盐性高、洗脱条件温和以及价格相对低廉等特点,已有一些成功应用实例。由于配基与抗体结合力较弱,使得HCIC介质在高流速下对抗体的动态结合载量较低,而聚合物接枝的离子交换层析介质可以显着提高蛋白的吸附容量、传质速率和动态结合载量。因此本文以高效抗体分离为目标,设计并制备了两种聚合物接枝型HCIC介质,比较蛋白吸附和传质性能,分析层析过程的固相条件(聚合物接枝、配基密度、接枝密度)和液相条件(pH和添加盐)的影响,并借助逆体积排阻层析(Inverse size exclusion chromatography,ISEC)、等温滴定量热仪(Isothermal titration calorimetry,ITC)和共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)进行了微观分析,以指导新型介质设计。主要结果如下:首先以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,以2-巯甲基咪唑(MMI)为配基,优化了配基偶联条件,制备了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介质。相比非接枝MMI介质,配基密度提高了 50%左右,达到2000μmol/g。以hIgG为模型蛋白,考察了系列葡聚糖接枝MMI介质的静态吸附、吸附动力学和层析柱动态吸附性能。结果表明,在近中性pH下,葡聚糖接枝介质对蛋白的吸附容量、结合力、传质速率和动态结合载量随着配基密度增加而持续增加,葡聚糖接枝MMI介质相比非接枝MMI介质具有更高的蛋白吸附容量、传质速率和动态结合载量。在pH 7.0～8.9时,饱和吸附容量保持在107.5～110.0 mg/g,受pH影响较小;在100 cm/h线性流速下hIgG动态结合载量达到38.3mg/g;在弱酸性条件下,葡聚糖接枝MMI介质的蛋白吸附容量和传质速率下降更显着,有利于蛋白解吸。此外,葡聚糖接枝MMI介质吸附能力受盐浓度的影响较小,但传质速率受盐浓度的影响较大。其次,针对葡聚糖接枝介质中HCIC配基同时存在于接枝层和基质孔道表面上的局限,利用表面引发的电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应,制备了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝MMI介质。结果表明,高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介质对hIgG具有更高的饱和吸附容量和传质速率。相比葡聚糖接枝MMI介质以及商业化HCIC介质MEP HyperCel,聚GMA接枝介质对hIgG具有更高动态结合载量。hIgG动态结合载量受流速影响较小,线性流速300 cm/h下可达34.6 mg/g,且具有明显的pH依赖吸附和耐盐吸附特性。此外,考察了从混合蛋白体系(hIgG/HSA=1:4)中分离hIgG和从CHO细胞培养液中分离单克隆抗体,聚GMA接枝HCIC介质均表现出良好的抗体分离和重复使用性能,50个周期循环使用的抗体纯度和收率分别稳定在98.5～99.8%和 90.2～96.9%。最后,为了从微观尺度揭示聚合物接枝MMI介质的吸附及传质机制,利用ISEC考察了介质孔结构的影响,利用ITC研究了不同蛋白(hIgG和BSA)的吸附热,利用CLSM实时观测了单个介质颗粒内蛋白的吸附、传质及洗脱过程。ISEC结果表明,不加盐时葡聚糖接枝链和聚GMA接枝链在基质表面形成叁维空间分布,有助于提高蛋白吸附容量;高盐浓度下,接枝链出现塌缩,且葡聚糖链的塌缩程度更明显,削弱了链传递效应,降低了蛋白传质速率。ITC结果表明,对于hIgG,在pH 8时,配基密度和盐浓度的增加会显着增加葡聚糖接枝MMI介质吸附hIgG的焓变和熵变,说明疏水相互作用增强;弱酸条件下,焓变和熵变急剧下降为负值,说明静电排斥作用主导了蛋白的解吸;对于BSA,吸附容量随着盐浓度的增加而显着下降,且焓变和熵变值为负,表明主要通过静电吸引力吸附BSA。CLSM结果表明,hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介质内,均体现出均质扩散控制的传质机理;hIgG在高配基密度葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内体现了更高的荧光强度;相比hIgG,BSA达到MMI介质内核所需时间更短;pH4.0时,中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内的荧光强度下降最为明显;以上结果与宏观吸附、传质及分离性能相匹配。本文从提高HCIC介质的蛋白载量出发,制备了两种新型聚合物接枝HCIC介质,探讨了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加盐和蛋白性质对聚合物接枝HCIC介质吸附和传质性能的影响,并利用ISEC、ITC、CLSM等手段从微观角度揭示了蛋白吸附和传质机理,结果显示孔内接枝可以明显提高HCIC介质对抗体的吸附容量、传质速率及动态载量,显示出良好的抗体分离应用前景。(本文来源于《浙江大学》期刊2017-04-01）
王存响[3]（2016）在《基于氨基苯并咪唑配基的疏水性电荷诱导层析介质制备和蛋白吸附研究》一文中研究指出疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge-induction chromatography, HCIC)是一种新型抗体分离方法,其功能配基兼有疏水和静电相互作用,中性条件下利用疏水作用吸附目标蛋白,调节pH改变配基的荷电特性,依靠静电排斥作用协助蛋白洗脱。目前,HCIC介质的蛋白吸附性能有待提高。本论文以抗体分离为目标,以5-氨基苯并咪唑(5-aminobenzimidazole,ABI)为功能配基,比较叁种配基偶联方式,制备不同配基密度的系列介质,考察配基密度和偶联方式对蛋白吸附的影响,以指导新型介质设计。主要结果如下：首先,以琼脂糖凝胶为基质,优化ABI配基偶联,制备了不同配基密度的ABI-B-6FF介质。以人免疫球蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,考察了静态吸附、吸附动力学和蛋白穿透行为,发现随着配基密度的增大,蛋白饱和吸附容量和有效扩散系数逐步增大,并趋于饱和；高配基密度介质具有更高的动态载量,且随流速影响小；hIgG吸附量高于BSA,随着配基密度增大,hIgG的吸附选择性有所提高；引入孔表面配基密度,发现与饱和吸附容量、有效扩散系数和动态载量呈线性相关。其次,以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,制备了不同配基密度的ABI-B-XL介质。以hIgG为模型蛋白,考察了pH、添加盐和配基密度对蛋白吸附的影响。发现pH影响显着,7.0～8.5之间吸附容量较高；添加盐对蛋白吸附影响不大,体现出较好的耐盐吸附特性；随配基密度增大,蛋白吸附容量、有效扩散系数和动态载量均呈现先增大后降低的趋势,最优配基密度为220 μmol/g,100cm/h线性流速下hIgG的动态载量达66.70 mg/g。结果表明,葡聚糖接枝ABI-B-XL介质比未接枝的ABI-B-6FF介质,抗体吸附性能显着提高。最后,以琼脂糖凝胶为基质,以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为接枝单体,采用原位聚合方法,通过控制GMA和配基添加量,制备了系列G-ABI-4FF介质,配基密度显着高于葡聚糖接枝介质。考察了配基密度对介质吸附hIgG的影响,发现随配基密度增大,蛋白吸附容量、有效扩散系数和动态载量均呈现先增大后降低的趋势,最优配基密度为330 μmol/g,100 cm/h线性流速下hIgG的动态载量高达82.10 mg/g,且随流速变化小。相比葡聚糖接枝介质,GMA接枝介质的抗体吸附性能进一步得到改善。本文围绕新型HCIC介质制备,系统考察了配基偶联方式和配基密度对抗体吸附的影响,发现孔内接枝可以有效提高吸附容量、促进孔内传质、改善动态载量,特别是原位聚合的GMA接枝介质,配基密度显着提高,配基分布更加均匀,有效改善了HCIC介质的动态结合性能,显示出良好的抗体分离应用前景。(本文来源于《浙江大学》期刊2016-05-01）
刘韬,林东强,张其磊,姚善泾[4]（2015）在《聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及抗体吸附研究》一文中研究指出疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic Charge-Induction Chromatography,HCIC)是一种新型的混合模式层析分离方法,在中性pH条件下通过疏水作用吸附蛋白,在酸性pH下以静电排斥作用实现蛋白洗脱,具有吸附容量高、选择性好、耐盐性强等优势。采用聚合物接枝可使分离介质具有更高的配基密度,且增加配基与目标蛋白的结合位点,提高动态载量。本文采用电子转移再生的原子转移自由基聚(本文来源于《2015年中国化工学会年会论文集》期刊2015-10-17）
王存响,林东强,刘韬,姚善泾[5]（2015）在《新型疏水性电荷诱导层析介质制备及人免疫球蛋白吸附》一文中研究指出疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography HCIC)是近年来发展的一种新型生物分离方法,其功能配基兼有疏水、氢键及静电相互作用,主要利用疏水作用吸附目标蛋白,通过调节缓冲液p H值,改变蛋白和介质的荷电特性,依靠静电排斥作用协助洗脱蛋白。HCIC吸附效率高,洗脱方便,且具有明显的(本文来源于《2015年中国化工学会年会论文集》期刊2015-10-17）
Wimonrat,Phottraithip[6]（2015）在《NMMO直接溶解法制备纤维素微球介质及疏水性电荷诱导层析应用》一文中研究指出从复杂料液中分离单一种类蛋白是一项非常艰巨的任务,需要经过一系列分离纯化步骤才能实现。与传统的化学产品的分离纯化相比,蛋白质纯化拥有明显的不同。首先,蛋白质对于外部条件非常敏感,剧烈的变化会造成蛋白质叁维结构的破坏,因此要求蛋白质纯化过程温和可控。其次,目标蛋白所在的培养液中的含量通常较低,而且存在大量的杂质成分,这给蛋白质纯化造成了较大困难,收率低、成本高,因此选择合适的蛋白质分离纯化技术具有重要意义。在各种蛋白质分离纯化方法中,层析技术是最重要的一类,该技术始于1906年Mikhail Tswett的发现。根据操作模式的不同,层析技术可以分为固定床、流化床以及扩张床。固定床是最为传统的层析操作模式,技术成熟,分辨率高,但是含有颗粒的料液会导致固定床床层堵塞,因此进入固定床的料液需进行前处理。流化床则可以直接处理含有颗粒的料液,但是流化床中沟流,返混现象严重,导致流化床分离效率较差,回收率低。扩张床是一种新型的层析操作模式,和流化床一样,可以实现从含有颗粒的料液中直接分离目标蛋白,扩张床床层与固定床相似,保持了相对稳定,因而保持了较高的分辨率和较好的分离效果。扩张床结合了固定床和流化床的优势,将固液分离、初步纯化以及蛋白浓缩集成为一个单元,是一项非常有潜力的新型集成化层析技术。扩张床的基本操作流程如下：首先,平衡缓冲液从床层底部以一定流速通入,在自下而上的液流作用下,具有一定的粒径与密度分布的介质向床柱上部移动,床层发生膨胀。当重力、阻力、拖曳力等作用力达到平衡时,不同粒径和密度的介质颗粒停止运动,停留在床层不同高度在床柱中形成稳定的床层分布。当床层稳定膨胀并完成平衡后,切换通入料液,料液中的颗粒物质,如细胞或细胞碎片等,可以通过颗粒之间存在空隙,而不堵塞床层,目标蛋白则被介质颗粒吸附。然后切换回平衡溶液,对床层进行冲洗,将未吸附的蛋白与杂质冲走。之后以洗脱液洗脱介质吸附的目标蛋白。完成洗脱后对床层进行再生和冲平衡,进入下一循环。由此可见,特殊设计的介质是实现扩张床运行的基础,决定了扩张床的吸附性能和分离效率。在用于制备扩张床介质的各类材料中,纤维素是一种优秀的备选对象。但是传统的纤维素介质主要通过纤维素黄酸酯方法来制备,反应条件苛刻,过程难以控制,且需要昂贵的试剂,一些副产物对环境有害。因此,本论文采用了N-甲基氧化吗啉(N-methyl morpholine oxide, NMMO)作为非衍生化“绿色”溶剂,直接溶解纤维素,并添加碳化钨作为增重剂,制备成纤维素-碳化钨复合微球基质。在吸附模式的选择上,本文选择了疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography, HCIC)。HCIC是一种新型的层析技术,与其他传统的层析技术相比,HCIC拥有以下优势：其一、HCIC介质具有较好的耐盐吸附能力,可以在较宽的盐浓度范围没保存良好的吸附性能,因此无需对料液进行加盐后稀释操作,节省前处理过程；其二、洗脱条件较为温和,减少了抗体变性或聚集的情况；其叁、HCIC介质性质稳定,可以承受较为苛刻的再生条件；其四、HCIC配基结合牢固,不会污染目标产物。因此,本文选择HCIC配基2-巯基咪唑(2-mercaptoimidazole, MI)偶联到纤维素基质上,制成疏水性电荷诱导层析介质,考察了新介质的蛋白吸附性能,并应用于免疫球蛋白G (IgG)的分离纯化。具体研究内容如下：(1)纤维素是地球上最为丰富的聚合物,是植物细胞重要的组成成分。纤维素是由葡萄糖组成的线性多聚体,含有大量氢键,是制备多孔颗粒基质的潜在材料。但是大量氢键的存在导致纤维素形态稳定,为了更好地利用纤维素进行制备,首先要对纤维素进行溶解。但是传统的溶解方法,比如纤维素黄酸酯方法,存在诸如成本过高或环境污染等不足。NMMO是一种无毒的、环状、脂肪族叔胺氧化物,常被用作有机合成中的氧化物。因为N-O的存在,NMMO拥有高度的极性,可溶于水,并形成氢键。基于这些特性,NMMO被研究者用于溶解纤维素,取得了良好的效果。本文使用NMMO作为溶剂,配合反相悬浮法制备纤维素-碳化钨复合微球,具体过程见图1。具体制备方法如下：使用NMMO作为非衍生化溶剂,在高温条件下直接溶解纤维素,加入碳化钨作为增重剂,充分搅拌混匀。为了防止与外界空气进行水分交换,整个反应体系置于干燥氮气环境下,同时加入抗氧化剂防止NMMO的降解。之后将纤维素-碳化钨悬浮液转入水相中,继续搅拌,同时降低温度,使纤维素结晶成球。在制备过程中,研究了纤维素溶解温度和时间、纤维素/NMMO/水混合溶液中的水含量、纤维素浓度、分散体系以及冷却过程对制备纤维素微球的影响。结果显示,纤维素的溶解度随着温度的提高以及时间的增加而增加,对于4 wt%纤维素溶液,105～110℃、反应30 min较为合适,进一步提升温度,则会造成NMMO的降解,不利于纤维素溶解。含水量对纤维素/NMMO/水混合溶液形成均一溶液非常重要,研究发现11～15 wt%的含水量较为适宜,低于11 wt%或高于15 wt%,都会导致难以成球。纤维素浓度影响结果显示,随着纤维素浓度加大,溶解时间延长,而且由于黏度过大,同样会导致难以成球。在分散体系控制中,油相与纤维素溶液的比例,分散剂的选择以及搅拌速度是叁个重要影响因素。当转速过大或油相过少是,纤维素液滴的碰撞机率加大,不利于成球。对于冷却过程控制的研究发现,NMMO在该过程中起主导作用。综合以上研究,确定了最终优化操作条件为：105℃,30 min进行溶解反应；纤维素/NMMO/水混合溶液的含水量为11～15 wt%：纤维素浓度为4%w/w；分散体系油相比例为3-6,转速700～1000 rpm,分散剂使用4% w/w Tween 80;冷却过程为每20 min下降5℃,下降范围为105℃至10℃。按照此条件,最终制得了具有良好的球形度、合适粒径分布的复合微球,经筛分得到了粒径较大的Cell-TuC-N-L微球和粒径较小的Cell-TuC-N-S微球,湿真密度约1.6-1.7g/mL,含水率48～53%,孔隙率80～90%,孔容分别为1.05～1.13mL/g (Cell-TuC-N-L)和0.92～1.08 ml/g Cell-TuC-N-S),孔道半径为72～91nm,比表面积为17.64～23.25m2/mL。与传统的纤维素黄酸酯化法相比,本论文所采用的NMMO直接溶解纤维素新方法具有更好的环境友好性,可以节省制备时间,显示出规模化制备的应用潜力。(2)扩张床作为一种新型的生物分离技术,稳定的膨胀床层对该技术的吸附性能和分离效率有重要影响。因此考察制备的新介质在扩张床中的膨胀性能以及床层扩散程度对评价该介质是否适合作为扩张床介质是必要的。衡量床层扩散程度的参数主要包括：理论塔板数(N)、理论塔板高度(HETP)、Bo准数,和轴向扩散系数。前两者来源于与流化床相似的理论塔板数模型,后两者来源于轴向扩散模型。4个参数都基于停留时间分布(RTD)实验的结果计算获得。N和HETP对床层轴向扩散的描述简单直观,N越大,HETP越小,床层轴向扩散程度越小；对于Bo准数而言,一般认为当Bo大于40时,可以认为液相近似为平推流,轴向扩散程度低。而对于Dax而言,当数值位于10-5 m2/s水平或以下时,可以认为床层稳定,轴向扩散程度低。通过4个参数的测定,可以获得扩张床床层轴向扩散程度较为准确的认识,评价介质用于扩张床操作的潜力。对于本文制备的纤维素-碳化钨复合微球Cell-TuC-N-S,膨胀特性结果显示,Cell-TuC-N-S具有良好的膨胀性能,膨胀率随着流速增加而增加。在膨胀率2-3范围内,操作流速可高达1100～1800 cm/h,与常见的商业化扩张床吸附基质Streamline系列(200～400 cm/h)和Streamline Direct (400～800 cm/h)相比,在提高操作流速上具有显着的优势。同时测定了轴向扩散性能,实验结果显示,随着流速增加,理论塔板数和理论塔板高度分别发生一定程度的下降与上升,说明流速提升会增加轴向扩散程度。Bo准数的测定显示,随着流速上升,Bo准数仅从127下降到94,明显高于床层稳定的40；而各流速条件下,轴向扩散系数Dax数值维持在10-5m2/s水平,说明Cell-TuC-N-S扩张床在总体上处于稳定状态,其轴向扩散程度较低,适合用于高流速条件的扩张床操作。(3)抗体作为重要的生物产品,已经成为的分离纯化技术的典型对象。目前用于抗体分离纯化的手段主要为Protein A亲和层析。该技术拥有出色的选择特异性,可以实现抗体高效高纯度的分离纯化。但Protein A亲和层析也有其不足之处,比如高昂的成本,苛刻的洗脱条件等。为此,近年来研究者开发了多种新型的分离技术,希望能够改善和弥补Protein A亲和层析的不足。疏水性电荷诱导层析(HCIC)就是一种新型的层析技术,它的配基可以将多种作用力结合在一起(通常为疏水作用和静电作用),其吸附作用呈现pH依赖性。即在中性条件下,HCIC的配基不带电荷,以疏水作用吸附目标蛋白；在酸性条件下,HCIC的配基和目标蛋白带有相同电荷,从而产生静电排斥力,解吸蛋白。因为独特的吸附原理,HCIC成为一种非常有潜力的抗体分离技术。本文采用二乙烯砜活化了制备得到的Cell-TuC-N-S基质,偶联上了新型的HCIC配基2-巯基咪唑(MI),制备成具有疏水性电荷诱导层析基团的Cell-TuC-N-S-DVS-MI介质,并考察抗体IgG在该介质上的吸附行为。制备原理如图2所示。首先对制备的活化过程进行优化,考察了二乙烯砜用量、pH和反应时间对活化过程的影响。在考察二乙烯砜用量影响时表明,随着用量增加,基质活化密度上升,在用量比例达到0.6-0.8后,活化密度趋于稳定；在研究pH对活化的影响发现,活化密度在pH 11时到达最大值；而反应时间影响结果显示,在反应进行3h后,基质活化密度不再上升,说明此时反应趋于饱和。综上考察结果,确定了活化反应条件为二乙烯砜用量比例1.0,pH 11,反应时间4 h,由此获得了Cell-TuC-N-S-DVS的活化密度为100μmol/mL的基质。在对该基质活化的基础上,偶联上配基MI。本文以3倍于活化基团的MI的摩尔比例用量进行反应,偶联上所要的配基MI,制得的Cell-TuC-N-S-DVS-MI的配基密度为60μmol/mL介质。采用新制备的Cell-TuC-N-S-DVS-MI进行了抗体吸附试验,以IgG为模型蛋白,测定了其静态吸附平衡数据,考察了新介质的蛋白吸附行为。结果发现,IgG吸附受pH影响显着,合适吸附pH值为7.0和8.0,饱和吸附容量Qm分别达到77.68和78.02 mg/mL介质；当pH下降至4.0时,IgG吸附容量显着下降。分析了pH值影响的主要原因,当pH处于IgG的等电点和配基的pKa以下时,IgG和配基之间存在静电排斥作用,导致蛋白质的解吸,符合HCIC的典型特征。(4)IgG是一种分子量为150 kDa左右的大生物分子,pI值为6-8左右,包含两条重链与两条轻链,分别为50 kDa和25 kDao IgG是免疫系统中最重要的一类抗体,广泛存在于血清和组织液中,有超过一半的抗体属于IgG。因此,IgG产品拥有非常高的应用和研究价值。如果采用传统的沉淀或过滤方法分离IgG,获得的IgG纯度较低,活性也较差,限制了IgG的应用。而在Protein A亲和层析分离IgG时,需要采用过酸的溶液进行洗脱,容易破坏IgG的活性。而文献以及我们实验室前期的研究表明,HCIC层析是一项非常有潜力的抗体分离手段,如商业化HCIC介质MEP HyperCel已经成功应用于抗体的分离。本文中制备的新型HCIC介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI也显示了对IgG分离的潜力。为了证明新型介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI分离抗体的可行性,以猪血浆中IgG作为分离对象,基于前期静态平衡吸附实验结果,采用固定床层析进行分离。血浆料液以pH 7.0上样,在酸性条件下进行洗脱,考察了洗脱液pH的影响,pH的范围为4.0、3.6、3.4和3.0,同时比较了用硫酸铵进行前处理后对分离效果的影响。结果显示,大部分杂质可在穿透阶段流出,采用pH 4.0～3.0条件下洗脱,IgG纯度可达80%以上,pH3.6洗脱可获得最大纯度为89.4%,纯化因子为3.35。其层析结果和电泳结果见图3。用硫酸铵对原料进行前处理后,可以显着提升IgG的回收纯度。其主要原因在于,高盐浓度会破坏蛋白质的表面水化层,增强了配基与IgG之间的疏水作用。以上结果表明,以MI为功能配基的新型HCIC介质可以从复杂的血浆料液中高效分离IgG,具有潜在的应用前景。本文还尝试了将介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI用于扩张床吸附分离血浆料液中IgG。实验中发现,所制备的介质比较容易发生破碎,导致碳化钨泄漏。这一现象的原因分析认为,一是操作流速过高,二是介质的机械强度不足。介质机械强度发生下降可能是由于活化与偶联过程导致纤维素基质结构发生变化。总之,本论文围绕新型纤维素复合基质的制备、功能化以及蛋白分离应用,展开了系统研究,获得了一些有价值的结果,为新型介质开发和抗体分离纯化提供一定的指导。基于本文工作,后续可以从以下几个方面进行进一步的研究：(1)虽然NMMO是一类非衍生溶剂,具有良好的环境友好特性,但是在本文研究过程中发现,NMMO可能造成纤维素氧化以及结构改变,不利于基质后期偶联配基反应。所以需要进一步寻找其他更合适的溶剂,用于溶解纤维素。(2)对于纤维素球的制备而言,冷却过程的控制非常重要。本文中考察并优化的制备条件仍然有限,需要对更多的溶剂和再生方法进行尝试,从而进一步改善纤维素球的制备过程。(3) SDS-PAGE结果显示IgG的洗脱峰中仍然残留一定数量的白蛋白与纤维蛋白原,影响了IgG的纯度,所以有必要进一步改进IgG的分离纯化过程。可以通过增加膜过滤等前处理手段进行改善。(4)本文中仅偶联了一种HCIC配基MI,后续研究中应尝试更多的HCIC配基,从而比较不同配基对分离纯化效果的影响。(5) Cell-TuC-N-S-DVS-MI以扩张床模式分离血浆料液中IgG,效果不是很好,应对该现象进行进一步研究,确定原因。并对介质机械强度不理想的情况进行改善。(本文来源于《浙江大学》期刊2015-10-01）
李菁[7]（2015）在《疏水性电荷诱导层析分离抗HER2和抗IL-12/23单克隆抗体研究》一文中研究指出单克隆抗体(单抗)作为重要的生物技术药物,具有巨大的市场需求和开发潜力,传统的蛋白A亲和层析分离存在一些不足,因此开发经济高效的单抗分离新方法和新介质具有十分重要的意义。疏水性电荷诱导层析(HCIC)作为近年来发展迅速的抗体分离新方法,具有一定优势,但分离工艺和配基结构有待进一步优化。本论文选择两种典型的单抗药物,抗HER2单抗和抗IL-12.23单抗,探讨HCIC从CHO细胞培养上清液中分离单抗,考察吸附性能,优化分离条件,比较分析商业化介质和本课题组开发的新型HCIC介质,为单抗规模化分离纯化提供了新思路。首先,将典型的HCIC介质MEP HyperCel应用于CHO细胞培养上清液中抗HER2单抗的分离。考察了细胞培养液上清液的特性,发现温度和pH对单抗稳定性有一定影响。考察了MEP HyperCel介质对抗HER2单抗的吸附性能,发现中性pH时吸附容量较高,酸性pH时吸附容量显着下降。考察了抗HER2单抗的动态载量,优化了分离工艺,确定了合适的上样和洗脱条件,实现了细胞培养液中抗HER2单抗的高效分离,纯度达到94.6%,得率约0.1mg/(ml料液)。其次,采用本课题组设计和制备的HCIC介质ABI,以氨基苯并咪唑为功能配基,从CHO细胞培养上清液中分离抗白介素12.23单抗(抗IL-12.23单抗),并与MEP HyperCel介质比较。结果表明,ABI介质对单抗的吸附性能良好,静态吸附容量略低于MEP HyperCel介质,但动态载量较高,受流速影响小,适合于高流速操作。优化了单抗分离工艺,包括上样和洗脱过程,确定了合适的分离条件,实现了细胞培养液中高效分离单抗,pH3.6条件下洗脱单抗纯度达到98.6%,收率为93.0%,明显优于MEP HyperCel介质。最后,采用本课题组设计、具有双功能配基色氨酸-氨基苯并咪唑的新型HCIC介质W-ABI,从CHO细胞培养上清液中分离抗IL-12.23单抗。结果表明,pn对W-ABI介质吸附单抗影响显着,中性pH范围内吸附容量较高,酸性pH条件下可以通过静电排斥作用实现解吸。W-ABI介质的动态载量受流速影响较小,高流速条件下仍保持较高的载量,性能优于MEP HyperCel介质。优化洗脱pH后,单抗纯度达97.2%,收率达93.3%,收率高于蛋白A亲和层析,洗脱组分中宿主细胞残留量(HCP)明显低于MEP HyperCel分离,显示出良好的应用前景。本论文围绕哺乳动物细胞培养液中高效分离单抗,从提高HCIC分离抗体的效率出发,对分离工艺进行了优化,探讨了两种新型HCIC介质的分离性能,分析了不同介质的分离效果,显示了新介质的应用潜力,证实了HCIC分离单抗的可行性,为单抗分离新方法和新介质的进一步开发和应用打下了基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2015-01-01）
童红飞[8]（2014）在《新型疏水性电荷诱导配基设计及层析分离抗体研究》一文中研究指出单克隆抗体是一类重要的生物技术药物,具有巨大的市场前景。基于蛋白A亲和层析的抗体分离过程存在一些局限,制约了抗体产业发展,开发经济高效的抗体分离新方法,具有重要的意义。疏水性电荷诱导层析(HCIC)是抗体分离的新方法,不过相关机制的认识仍不够深入,分离工艺尚待完善,配基性能也有待提高。本论文以抗体分离为目标,结合实验手段和计算机分子模拟方法,分析HCIC分离的分子机制,设计新型配基,探讨HCIC分离抗体的新工艺。首先比较了HCIC介质(MEP HyperCel和Bestarose-4FF-MMI)和蛋白A亲和介质的吸附分离性能,进行了单抗分离工艺的优化,发现优化后的HCIC抗体分离工艺与蛋白A亲和层析的效果接近,但仍有进一步提升的空间。进一步以牛血清白蛋白(BSA)为典型杂质,系统考察了溶液条件(pH、盐以及添加辛酸钠等)对蛋白吸附和解吸行为的影响,探讨了蛋白和MEP配基间的相互作用。通过调节pH、离子强度和添加辛酸钠可以显着提高HCIC结合抗体的选择性,有效降低BSA在HCIC介质上的吸附,提高抗体分离的效率。采用计算机分子模拟方法探讨了HCIC配基和抗体间的相互作用,从分子尺度揭示了HCIC的分离机制。结果表明,抗体分子上存在多个可能的结合位点,疏水相互作用、pi-pi、pi-日离子以及氢键作用在配基-抗体结合过程中起了重要作用。证实了高配基密度对抗体吸附的重要性,并观察到类似于诱导契合的蛋白构象调整,以及典型的多位点协同作用。酸性条件下,碱性氨基残基与质子化的HCIC配基间存在静电排斥力,是蛋白解吸的主要推动力。通过分子动力学模拟研究了抗体的Fc片段和天然的Fc特异性配基间分子识别和结合模式。结果显示,疏水作用是特异性配基结合的主要驱动力。进一步通过丙氨酸扫描方法,分析比较了配基-抗体间的相互作用能,鉴别出配基和Fc结合界面上的热点残基,提出了基于色氨酸或酪氨酸残基的两种结合模式,为仿生Fc亲和配基的设计提供了指导。设计了两种HCIC新配基：氨基苯并咪唑(ABM)和色氨酸-氨基苯并咪唑双功能配基(W-ABM),成功偶联于琼脂糖凝胶,制备了新型HCIC介质,考察了吸附性能,并用于抗体分离。结果表明,在中性pH范围内,两种介质对IgG具有较高的饱和吸附容量,对BSA吸附量低,且对抗体吸附具有显着的非盐依赖特性。在弱酸性pH条件下,能够实现抗体的有效回收。两种介质的动态载量受流速影响较小,在高流速下仍能维持较高的载量,性能优于商业化的MEPHyperCel介质。进一步实现了模拟血清和细胞培养上清液中分离抗体,结果表明两种介质分离性能优良,显示出良好的应用前景。本又从提高HCIC分离抗体的效率出发,对分离工艺进行了优化,探讨了HCIC分离的分子机制,设计并制备了两种性能良好的HCIC新介质,成功用于抗体分离,有助于HCIC在抗体制备中的推广应用。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-05-01）
童红飞,林东强,姚善泾[9]（2011）在《疏水性电荷诱导层析纯化免疫球蛋白IgY》一文中研究指出利用疏水性电荷诱导层析(HCIC)从鸡血中分离免疫球蛋白IgY。采用经辛酸预处理后的血浆上清液作为原料,直接用HCIC分离纯化IgY。考察了两种HCIC介质,市售介质MEP HyperCel和实验室自制介质Bestarose-DVS-MMI,优化了上样pH、洗脱pH和上样量等条件。研究发现,以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的Bestarose-DVS-MMI介质优于MEP HyperCel介质,前者分离IgY的纯度和收率较高,HPLC分析IgY纯度可达92%以上,收率约95%。通过配基结构比较和表面电势分析,探讨了HCIC分离IgY的机制。结果表明,采用HCIC可以实现IgY的高效分离,为从血液中分离免疫球蛋白提供了新方法。(本文来源于《化工学报》期刊2011年06期）
王红寅[10]（2011）在《疏水性电荷诱导层析分离抗体的分子模拟研究》一文中研究指出疏水性电荷诱导层析(HCIC)是一项新型生物分离技术,在抗体分离中得到应用,但目前对HCIC配基-抗体间相互作用的分子机制认识还十分缺乏,“疏水性电荷诱导”的概念也仅停留在宏观吸附实验的表征,缺少配基与蛋白的作用位点、作用方式等相关信息,计算机分子模拟方法的发展为这方面的研究提供了有效工具。本文主要采用分子模拟方法探讨HCIC分离抗体的分子机制,取得主要结果如下：首先结合分子对接和分子动力学(MD)模拟,考察了典型HCIC配基——4-巯乙基吡啶(MEP)与IgG分子Fc片段之间的相互作用。通过分子对接搜索得到Fc-A链蛋白表面12个可能与MEP结合的位点,用MD模拟考察了其中6个位点的结合性能。发现MEP配基能稳定结合在Fc-A链TYR319和LEU309附近位点1的疏水口袋上,并与二者形成氢键作用。pH 4.0酸性条件下,原先稳定结合在位点1的MEP快速从Fc-A链表面脱离,主要原因是MEP和Fc-A间的静电排斥作用。该结果从分子水平验证了HCIC独特的作用机理：疏水相互作用主导吸附,静电排斥作用协助解吸。进一步考察了配基中空间臂、硫醚硫原子和杂环等功能基团对蛋白结合的影响。结果表明,含有砜基的空间臂能与蛋白表面的氨基酸残基形成氢键,从而加强配基与蛋白的结合,但在洗脱时,这种氢键反而不利于蛋白的解离。模拟中未观察到硫醚硫原子对吸附的特殊贡献,可以用氧原子或氮原子替代。不同的杂环类型会影响配基与蛋白的结合,能量分析表明,与蛋白间范德华相互作用能的强弱顺序依次为：2-巯基苯并咪唑(MBI)>MEP>2-巯基-1-甲基咪唑(MMI)>3-巯基-1,2,4-叁氮唑(MTR),与配基疏水性强弱的顺序一致。pH 4.0酸性条件下,带正电荷的MMI和MBI很快从Fc-A表面解吸,但仍呈电中性的配基能继续结合在原疏水口袋上。为使模拟更加接近真实层析条件,进一步引入纤维素基质模型,构建了纤维素基质平面-配基模拟体系,考察了Fc-A链在固定化MEP配基上的吸附性能。在模拟进行的4 ns时间尺度内,Fc-A能稳定地通过位点1的疏水口袋结合在固定化MEP单一配基或配基网上。这些模拟结果有助于解释HCIC实验中的诸多现象。最后结合静态吸附实验和等温滴定量热实验,研究了以IgG为主要成分的人Y球蛋白在MEP HyperCel介质上吸附的焓变(-1.68kcal/mol)、熵变(7.56cal/(mol'K))和吉布斯自由能变(-3.93 kcal/mol)等热力学参数,并由此推断驱动IgG在MEP配基上吸附的主要作用力为疏水相互作用,此外还包括范德华相互作用和氢键,进一步验证了分子模拟结果。本文探讨了HCIC配基和IgG之间的分子相互作用,考察了pH和配基结构的影响,证实了HCIC的抗体分离机制,并通过热力学分析验证了分子模拟结果。相关研究表明,分子模拟是蛋白质-配基相互作用研究的有效工具,有助于深入了解蛋白质层析分离的分子机制,促进新型配基设计和新方法的应用。(本文来源于《浙江大学》期刊2011-02-01）
疏水性电荷诱导层析论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography,HCIC)是一种新型抗体分离技术,其配基兼有疏水、静电、氢键等多种相互作用,具有选择性好、耐盐性高、洗脱条件温和以及价格相对低廉等特点,已有一些成功应用实例。由于配基与抗体结合力较弱,使得HCIC介质在高流速下对抗体的动态结合载量较低,而聚合物接枝的离子交换层析介质可以显着提高蛋白的吸附容量、传质速率和动态结合载量。因此本文以高效抗体分离为目标,设计并制备了两种聚合物接枝型HCIC介质,比较蛋白吸附和传质性能,分析层析过程的固相条件(聚合物接枝、配基密度、接枝密度)和液相条件(pH和添加盐)的影响,并借助逆体积排阻层析(Inverse size exclusion chromatography,ISEC)、等温滴定量热仪(Isothermal titration calorimetry,ITC)和共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)进行了微观分析,以指导新型介质设计。主要结果如下:首先以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,以2-巯甲基咪唑(MMI)为配基,优化了配基偶联条件,制备了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介质。相比非接枝MMI介质,配基密度提高了 50%左右,达到2000μmol/g。以hIgG为模型蛋白,考察了系列葡聚糖接枝MMI介质的静态吸附、吸附动力学和层析柱动态吸附性能。结果表明,在近中性pH下,葡聚糖接枝介质对蛋白的吸附容量、结合力、传质速率和动态结合载量随着配基密度增加而持续增加,葡聚糖接枝MMI介质相比非接枝MMI介质具有更高的蛋白吸附容量、传质速率和动态结合载量。在pH 7.0～8.9时,饱和吸附容量保持在107.5～110.0 mg/g,受pH影响较小;在100 cm/h线性流速下hIgG动态结合载量达到38.3mg/g;在弱酸性条件下,葡聚糖接枝MMI介质的蛋白吸附容量和传质速率下降更显着,有利于蛋白解吸。此外,葡聚糖接枝MMI介质吸附能力受盐浓度的影响较小,但传质速率受盐浓度的影响较大。其次,针对葡聚糖接枝介质中HCIC配基同时存在于接枝层和基质孔道表面上的局限,利用表面引发的电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应,制备了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝MMI介质。结果表明,高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介质对hIgG具有更高的饱和吸附容量和传质速率。相比葡聚糖接枝MMI介质以及商业化HCIC介质MEP HyperCel,聚GMA接枝介质对hIgG具有更高动态结合载量。hIgG动态结合载量受流速影响较小,线性流速300 cm/h下可达34.6 mg/g,且具有明显的pH依赖吸附和耐盐吸附特性。此外,考察了从混合蛋白体系(hIgG/HSA=1:4)中分离hIgG和从CHO细胞培养液中分离单克隆抗体,聚GMA接枝HCIC介质均表现出良好的抗体分离和重复使用性能,50个周期循环使用的抗体纯度和收率分别稳定在98.5～99.8%和 90.2～96.9%。最后,为了从微观尺度揭示聚合物接枝MMI介质的吸附及传质机制,利用ISEC考察了介质孔结构的影响,利用ITC研究了不同蛋白(hIgG和BSA)的吸附热,利用CLSM实时观测了单个介质颗粒内蛋白的吸附、传质及洗脱过程。ISEC结果表明,不加盐时葡聚糖接枝链和聚GMA接枝链在基质表面形成叁维空间分布,有助于提高蛋白吸附容量;高盐浓度下,接枝链出现塌缩,且葡聚糖链的塌缩程度更明显,削弱了链传递效应,降低了蛋白传质速率。ITC结果表明,对于hIgG,在pH 8时,配基密度和盐浓度的增加会显着增加葡聚糖接枝MMI介质吸附hIgG的焓变和熵变,说明疏水相互作用增强;弱酸条件下,焓变和熵变急剧下降为负值,说明静电排斥作用主导了蛋白的解吸;对于BSA,吸附容量随着盐浓度的增加而显着下降,且焓变和熵变值为负,表明主要通过静电吸引力吸附BSA。CLSM结果表明,hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介质内,均体现出均质扩散控制的传质机理;hIgG在高配基密度葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内体现了更高的荧光强度;相比hIgG,BSA达到MMI介质内核所需时间更短;pH4.0时,中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内的荧光强度下降最为明显;以上结果与宏观吸附、传质及分离性能相匹配。本文从提高HCIC介质的蛋白载量出发,制备了两种新型聚合物接枝HCIC介质,探讨了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加盐和蛋白性质对聚合物接枝HCIC介质吸附和传质性能的影响,并利用ISEC、ITC、CLSM等手段从微观角度揭示了蛋白吸附和传质机理,结果显示孔内接枝可以明显提高HCIC介质对抗体的吸附容量、传质速率及动态载量,显示出良好的抗体分离应用前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
疏水性电荷诱导层析论文参考文献
[1].袁晓明.疏水性电荷诱导层析介质的吸附性能和作用机制研究[D].浙江大学.2018
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[4].刘韬,林东强,张其磊,姚善泾.聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及抗体吸附研究[C].2015年中国化工学会年会论文集.2015
[5].王存响,林东强,刘韬,姚善泾.新型疏水性电荷诱导层析介质制备及人免疫球蛋白吸附[C].2015年中国化工学会年会论文集.2015
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[10].王红寅.疏水性电荷诱导层析分离抗体的分子模拟研究[D].浙江大学.2011