一个玉米AP2类转录因子基因的克隆和原核表达载体构建

论文摘要

植物在生长发育过程中,常遭受高湿、低温、干旱、高温等非生物因素的胁迫,轻者使植物生长发育受阻,重者导致植株死亡。在逆境条件下,植物物体内通常会发生一系列的生理生化反应,并且形成了一定的胁迫应答机制。通过一系列信号传递过程最终激发转录因子,转录因子与顺式作用元件结合,激活形成RNA聚合酶Ⅱ转录复合物,从而启动基因的转录表达。因此转录因子在植物的信号传递、相关功能基因的表达调控、以及发育阶段的调控中起着非常重要的作用。AP2/DREB类转录因子家族广泛存在于植物中,参与植物细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因表达调控。其中ERF家族转录因子作为一类逆境相关转录因子,在植物防卫反应中具有重要的作用。据报道,ERF转录因子可通过与GCC-box顺式作用元件结合参与植物对高湿、低温、干旱、高温等非生物胁迫的应答过程。本实验旨在利用生物化学和分子生物学的手段,从玉米品种A318中克隆到AP2/DREB类转录因子,并对其表达模式进行初步探讨,对于玉米的抗逆育种以及阐述玉米耐受胁迫的分子机制都有着重要的意义。本研究取得以下进展：本文利用油菜UniGene数据库,以拟南芥AP2/DREB类转录因子保守序列为信息探针,分离得到1个玉米ERF家族-B2亚族的转录因子BT039300.1。通过PCR和RT-PCR方法从玉米自交系A318的穗发芽材料中克隆了该基因。序列分析显示,克隆的BT039300.1转录因子与电子克隆的基因序列差异很小,只有1个碱基位点不同,编码的氨基酸一致。并从氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性／亲水性、序列比对、进化树、功能域、二级结构和三级结构等方面进行了预测和较为全面的分析。结果显示BT039300.1全长为1350bp,含有一个完整的开放阅读框架1023 bp,编码340个氨基酸,具有一段非常保守的ERF结构域。构建的进化树表明,BT039300.1属于EREBP亚族,与属于ERF家族的B2亚族的RAP2.12聚为一枝,遗传关系较近。BT039300.1是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtERFl相似。荧光定量研究结果表明,授粉后15天穗发芽材料穗轴中表达量最高,而普通材料胚乳中表达量最高；授粉后20天穗发芽材料茎中表达量最高,普通材料胚乳中表达量最高；授粉后25天穗发芽材料茎中表达量最高,普通材料茎中也是表达量最高。另外,本实验将该基因构建入原核表达载体中,为深入研究该基因在玉米抗逆调控中的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 植物转录因子研究现状
• 1.1.1 植物转录因子的定义
• 1.1.2 植物转录因子的分类
• 1.1.3 转录因子的结构与功能
• 1.1.4 转录因子的活性
• 1.2 AP2/EREBP类转录因了的研究进展
• 1.2.1 AP2/EREBP类转录因子的起源与进化
• 1.2.2 AP2/EREBP类转录因子的DNA结合区
• 1.2.3 AP2/EREBP类转录因子的分类
• 1.2.4 AP2/EREBP类转录因子与目标DNA的结合
• 1.2.5 与植物发育有关的AP2/EREBP类转录因子
• 1.2.6 与植物胁迫应答有关的AP2/EREBP类转录因子
• 2 立题依据
• 3 材料与方法
• 3.1 材料玉米自交系A318中AP2类转录因子的克隆
• 3.1.1 植物材料的获得
• 3.1.2 分子生物学试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 引物设计
• 3.1.5 实验方法
• 3.2 AP2类转录因子的生物信息学分析
• 3.3 原核表达载体的构建
• 3.3.1 ORF扩增引物设计
• 3.3.2 载体的制备
• 3.3.3 目的插入片段的制备
• 3.3.4 连接及转化
• 3.3.5 阳性克隆的鉴定
• 3.4 AP2基因实时荧光定量PCR检测
• 3.4.1 供试材料
• 3.4.2 仪器和试剂
• 3.4.3 荧光定量PCR引物设计
• 3.4.4 试验方法
• 4 结果与分析
• 4.1 电子克隆方法克隆玉米AP2基因
• 4.2 RT-PCR验证克隆试验
• 4.2.1 自交系A318胚RNA的提取
• 4.3 克隆片段的序列分析
• 4.3.1 目的片段克隆
• 4.3.2 测序结果的分析
• 4.3.3 与相关转录因子的核苷酸和氨基酸序列比较
• 4.3.4 BT039300.1转录因子的功能域和二级结构预测
• 4.3.5 BT039300.1转录因子推导的氨基酸序列的疏水性/亲水性分析
• 4.3.6 BT039300.1跨膜结构预测
• 4.3.7 BT039300.1转录因子的卷曲螺旋和核定位信号预测分析
• 4.3.8 BT039300.1与AP2/EREBP类转录因子的进化树构建
• 4.3.9 BT039300.1编码的氨基酸的理化性质分析
• 4.3.10 BT039300.1转录因子的三级结构预测与分析
• 4.4 原核表达载体的构建
• 4.5 实时荧光定量PCR检测BT039300.1基因表达
• 4.5.1 RNA纯度和完整性分析
• 4.5.2 BT039300.1和GAPDH基因标准曲线的绘制
• 4.5.3 检测BT039300.1和GAPDH基因表达的准确性
• 4.5.4 cDNA模板梯度稀释扩增曲线
• 4.5.5 BT039300.1基因扩增的溶解曲线分析
• 4.5.6 BT039300.1基因表达的重复性检测
• 4.5.7 不同组织 BT039300.1基因的表达情况
• 5 小结与讨论
• 5.1 电子克隆
• 5.2 玉米材料的获得
• 5.3 RNA的提取
• 5.4 BT039300.1基因的结构与功能预测
• 5.5 荧光定量PCR的选择使用
• 5.6 pET32a表达载体的选择与BT039300.1蛋白的展望
• 参考文献
• 致谢