论文摘要
植酸酶是一类催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸的酶，添加于食品和饲料中，可以提高磷的吸收利用率，提高食品和饲料的营养价值；减少植酸对微量元素的螯合，消除植酸所引起的抗营养作用；同时也减少了动物粪便中植酸磷的含量，降低了磷对环境的污染，有利于保护环境等。因此，植酸酶的研究与应用具有重大的理论和现实意义。目前国内外对植酸酶及其基因进行了大量研究，构建了表型为甲醇利用型和非甲醇利用型的酵母工程菌表达植酸酶。本实验室已构建了一株表型为甲醇利用型的菌株，研究发现，重组植酸酶的表达量以及酶学性质与出发菌表达的植酸酶相比具有较大的变化，特别是pH的适用范围得到了较大的拓宽。试验通过原生质体法把外源表达载体转化到毕赤酵母中，然后外源表达载体双交换整合到毕赤酵母染色体上，获得表型为非甲醇利用型的酵母工程菌来表达植酸酶，从而研究两种表型的酵母工程菌对植酸酶表达的影响，为进一步研究影响植酸酶基因在毕赤酵母中表达的因素奠定理论基础；也为植酸酶的工业化生产提供更为优良的菌株奠定基础。因此试验在实验室前期研究的基础上，做了如下研究：1．质粒DNA的提取及线性化用质粒少量制备试剂盒提取pPIC9K-phyA质粒DNA，用DraⅠ酶酶切pPIC9K-phyA质粒，电泳检测表明已彻底酶切后，用酚/氯仿抽提，无水乙醇进行沉淀回收，并用10μL TE溶解，经紫外分光法检测DNA浓度达500ng/μL。2．毕赤酵母（GS115）原生质体的制备及转化用Zymolyase在高渗缓冲液中处理酵母细胞制备原生质体，在PEG和CaCl2存在下与外源DNA温育，将外源DNA导入原生质体，再经高渗选择性培养基进行再生培养，在培养24小时后，平板上出现较多的小菌落，表明利用原生质体转化也可获得较多转化子。3．转化子的表型筛选和PCR鉴定于30℃培养箱内培养原生质体转化的细胞，直至长为大小适中的单菌落，在MM和MD平板上进行表型筛选。在MD平板上生长正常而在MM平板上生长缓慢的初步鉴定为MutS型。提取初步鉴定为MutS型转化子的总DNA，用5’AOX1引物和3’AOX1引物进行PCR扩增，PCR产物电泳出现一条约1.8kb的目的带，表明此转化子为MutS型，共获得21个MutS型重组子。4．MutS重组子和Mut+重组子表达植酸酶的量以及酶学性质比较。（1）Mut+重组子在诱导培养168小时之内，植酸酶的表达量随时间的延长而增加，到168小时接近高峰，最高酶活达到143958.3U/mL；MutS重组子在诱导培养192小时之内植酸酶的表达量随时间的延长而增加，到192小时接近高峰，最高酶活达到141058.3U/mL。两种表型工程菌株表达产物的分子量都介于70kDa～97kDa之间。（2）最适pH研究结果表明，两种重组酵母表达的植酸酶最适作用pH值都有两个（37℃条件下反应1小时），分别为2.5～3.0和5.0～5.5，pH2.5与pH3.0峰值相当，pH5.0与pH5.5峰值相当，在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性，pH7.0时酶活性急剧下降，两种重组酵母表达的植酸酶适应范围都得到显著拓宽；在pH5.5、不同温度条件下的酶活性测定结果表明，两种重组酵母表达的植酸酶最适作用温度为55℃左右，二者在50℃～55℃之间均有较高的酶活性，说明两种工程菌的植酸酶温度适应范围有所提高；耐热性研究的结果表明，两种重组酶耐热性都比天然植酸酶有所改善。试验结果表明，两种表型的酵母工程菌对植酸酶的表达量以及酶学性质无显著影响。