猪圆环病毒2型人工感染和重组腺病毒基因工程疫苗研究

论文摘要

PCV2（poreine circovirus 2）主要引起断奶仔猪多系统衰弱综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），是以发热、渐进性消瘦、呼吸困难和黄疸等征状为特征的慢性传染病。PMWS主要感染断奶仔猪和育肥猪，于1991年首先发现于加拿大西部，目前，PMWS已遍布北美、亚洲、欧洲等世界各地，成为严重危害世界养猪业的重要疫病之一。 本研究在临床征状和病理学观察的基础上用PCR方法，对2002年1月--2002年12月江苏、上海、山东、江西、安徽和浙江等省市的100家猪场146例患有断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）的猪肺脏和淋巴结，进行了PCV2和PRRSV基因检测，发现24家猪场28例病料为PCV2阳性，64家猪场77例病料为PRRSV阳性，其中19家猪场21例病料同时感染了PCV2和PRRSV。从送检的病料中分离到两株PCV2，即PCV2-SH和PCV2-AH。经PCR扩增部分ORF2基因和序列分析，结果显示，两个分离株部分ORF2与国外分离毒株同源性为92％-99％，两个分离株部分ORF2基因存在一定差异。表明我国PMWS患病猪群广泛存在PCV2感染，而且大部分同时感染了PRRSV；不同地区PCV2存在一定基因差异，它们可能来源于不同国家或地区。 将24头断奶仔猪（32日龄）随机分为6组即PCV2攻毒后KLH刺激组、PCV2+PRRSV混合感染组、PCV2攻毒组、PRRSV攻毒组、钥匙孔血蓝蛋白（KLH）刺激组和对照组。每组4头，进行PCV2攻毒试验。攻毒后隔离饲养，观察临床征状并对濒死猪进行病理解剖。攻毒后不同时间采血或组织脏器，用PCR和RT-PCR检测病毒。结果为空白对照组和KLH刺激组未出现临床征状，PCV2和PRRSV攻毒组仅表现短暂的体温升高，而PCV2攻毒KLH刺激组和PCV2+PRRSV混合感染组出现明显的临床征状，其中PCV2攻毒后KLH刺激组的2头猪在攻毒后11天濒临死亡，宰杀后脏器出现明显的病理变化，各攻毒猪于攻毒后四天出现病毒血征，宰杀后肺脏、淋巴结均检测到PCV2和PRRSV。以上结果说明PCV2是引起PMWS的主要病原，KLH是PMWS的重要诱因。PCV2和PRRSV混合感染可引起PMWS。本研究成功复制了PMWS，为该病免疫预防研究奠定了重要基础。 PCV2是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）的必需病原，含

论文目录

• 原创性声明
• 学位论文版权使用授权书
• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪圆环病毒的研究进展
• 1 猪圆环病毒发现及分类地位
• 2 猪圆环病毒的分子生物学特征
• 3 猪圆环病毒引起的疾病
• 4 PCV2疫苗的研究
• 参考文献
• 第二章 断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）
• 1 流行特点
• 2 临床征状和剖检变化
• 3 病理变化
• 4 PMWS引起的免疫抑制
• 5 混合感染
• 6 诊断与防治
• 参考文献
• 第三章 仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）分子流行病学调查
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 2.1 临床征状及流行病学调查
• 2.2 PCV2的检测
• 2.3 PRRSV的检测
• 2.4 病毒PCV2的分离与鉴定
• 2.5 PCV2部分ORF2基因序列分析
• 2.6 病理解剖和病理组织学观察
• 3 结果
• 3.1 临床征状和流行病学调查
• 3.2 病理解剖和病理组织学观察
• 3.3 PCV2和PRRSV检测
• 3.4 病毒的鉴定
• 3.5 Cap基因部分序列同源性比较
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）感染和PMWS的复制
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 2.1 试验动物
• 2.2 动物试验分组
• 2.3 PCR检测PCV2
• 2.4 RT-PCR检测PRRSV
• 2.5 病理解剖和病理组织学观察
• 2.6 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 临床征状
• 3.2 体重
• 3.3 肉眼病理变化
• 3.4 病理组织学变化
• 3.5 病毒血征检测
• 3.6 内脏组织中病毒检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 2.1 Cap蛋白基因的扩增
• 2.2 重组质粒rShuttle-ORF2的构建与鉴定
• 2.3 重组质粒rAd-ORF2的构建和鉴定
• 2.4 重组质粒rAd-ORF2转染
• 2.5 重组病毒的噬斑纯化
• 50的测定'>2.6 重组病毒的TCID₅₀的测定
• 2.7 重组腺病毒Cap蛋白表达的鉴定
• 3 结果
• 3.1 Cap蛋白基因的扩增
• 3.2 重组质粒rShuttle-ORF2的构建与鉴定
• 3.3 重组质粒rAd-ORF2的构建与鉴定
• 3.4 转染HEK-293A细胞与病毒收获
• 3.5 重组腺病毒pAd-Cap蛋白表达的鉴定
• 3.6 重组病毒的克隆及稳定性试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒免疫特性的研究
• 1.材料
• 2 方法
• 2.1 小鼠免疫试验
• 2.2 猪体免疫攻毒试验
• 3 结果
• 3.1 小鼠免疫试验
• 3.2 猪体免疫攻毒试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 第七章 PCV2 Cap和PRRSV GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和定
• 1.材料
• 2 方法
• 2.1 Cap蛋白基因的扩增
• 2.2 重组质粒rShuttle-ORF2-ORF5的构建与鉴定
• 2.3 重组质粒rAd-ORF2的构建和鉴定
• 2.4 重组质粒rAd-ORF2-ORF5转染
• 2.5 重组病毒的纯化
• 50的测定'>2.6 重组病毒的TCID₅₀的测定
• 2.7 重组腺病毒Cap-GP5蛋白表达的鉴定
• 3 结果
• 3.1 重组质粒rShuttle-ORF2-ORF5的构建与鉴定
• 3.2 重组质粒rAd-ORF2-ORF5的鉴定
• 3.3 质粒转染与病毒收获
• 3.4 重组腺病毒rAd-Cap-GP5蛋白表达的鉴定
• 3.5 稳定性试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 第八章 PCV2 Cap和PRRSV GP5融合蛋白重组腺病毒免疫特性的研究
• 1.材料
• 2 方法
• 2.1 小鼠免疫试验
• 2.2 猪体免疫攻毒试验
• 3 结果
• 3.1 小鼠免疫试验
• 3.2 猪体免疫攻毒试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文