菊糖果糖转移酶的研究 ——菌种筛选、分离纯化及克隆表达

论文摘要

双果糖酐III是近年来人们发现的一种新型天然功能性甜味剂,具有促进Ca、Fe、Mg、Zn、Cu等矿物质元素的吸收、增进骨骼生长、利于排尿、改善便秘及抑制蛀牙等功能,且甜度较高、能量值低,具有良好的理化性质,耐热、耐酸,适用于焙烤食品、饮料、糖果和医药制剂中。生物法制备双果糖酐III是近年来一个研究热点,菊糖果糖转移酶可水解菊糖,生成双果糖酐III,转化率高,方法可行,应用潜力极大。本文从土壤中分离、筛选出一株菊糖果糖转移酶产生菌,并对其进行生理生化等性质研究,结合16S rDNA序列分析,鉴定为金黄节杆菌,命名为Arthrobacter aurescens SK8.001,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为No. M 207185。通过LC-MS-MS及（13）C-NMR进行产物鉴定,确定菊糖酶解主要产物为双果糖酐III,少量产物为蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）等低聚果糖。利用DTF-02型阳离子交换树脂分离纯化了酶法合成的双果糖酐III,研究了温度、固形物含量、上样量、流速的影响,确定其最佳分离条件为:柱温60 oC、流速1.0 mL/min、固形物含量为20%、上样体积为5 mL。此时分离获得的双果糖酐III纯度为98%,回收率达95%以上。研究了多种碳源对菊糖果糖转移酶诱导合成的影响,结果表明菊糖和双果糖酐III对菌体产菊糖果糖转移酶有显著促进作用,低聚果糖可低水平诱导。详细研究并对比了菊糖和双果糖酐III不同浓度下诱导合成菊糖果糖转移酶的过程。高浓度菊糖（30-50 g/L）不抑制菌体生长,不阻遏菊糖果糖转移酶合成;30 g/L以上双果糖酐III浓度抑制菌体生长,阻遏菊糖果糖转移酶合成。粗酶液经乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱和Superdex 200凝胶过滤等步骤,获得的菊糖果糖转移酶经SDS-PAGE电泳,显示为单一谱带;结合SDS-PAGE和排阻凝胶色谱的测定结果,表明A. aurescens SK8.001菊糖果糖转移酶是单亚基蛋白,分子量约40 kDa。对菊糖果糖转移酶的酶学性质进行了全面的研究。发现该酶最适反应pH为5.5,在pH 4.5-7.5的范围内放置24 h还能保持50%以上的酶活;在60 oC-70 oC间表现出最大酶活,在60 oC下保温4 h,酶液仍保持86.5%的初始酶活;化学修饰实验结果表明Trp可能是菊糖果糖转移酶催化过程中的关键氨基酸;金属离子、EDTA、SDS等物质对该酶酶活影响不大,说明此酶是非金属离子结合酶;该酶Km为0.52 mM,最大反应速度为0.3μM DFA III/ mL·min;该酶最小作用底物为蔗果四糖（GF3）;其N-端氨基酸残基序列依次为AEGAKASPLNSPNVYDVT。根据N-端氨基酸序列比对结果结合酶学性质,可判定A. aurescens SK8.001菊糖果糖转移酶是产双果糖酐III型菊糖果糖转移酶家族的新成员。通过体外PCR扩增获得并成功克隆该菊糖果糖转移酶的基因,该基因全长为1353 bp,编码450个氨基酸,该基因提交到GenBank数据库,数据库登记号为:HM138085。为研究信号肽对E. coli BL21（DE3）表达菊糖果糖转移酶的影响,根据菊糖果糖转移酶的基因结构,构建了三个表达系统: BL21（pET22b-ift-W）、BL21（pET22b-ift-P）、BL21（pET22b-ift-In）,分别带有原菊糖果糖转移酶信号肽、pelB信号肽、不带信号肽的胞内表达。对比其胞内、胞外产酶状况,三个工程菌均表达活性菊糖果糖转移酶,其中BL21（pET22b-ift-W）是一个成功的分泌表达系统。研究了分泌表达工程菌E. coli BL21（pET22b-ift-W）发酵过程,胞内酶活最高值出现在12 h处,达到119 U/mL;胞外酶在72 h时达到酶活顶点,酶活为81.0 U/mL,是原野生菌培养基优化后酶活的4.1倍。分离纯化重组蛋白,验证了其菊糖果糖转移酶活性,在pH 6.0和55 oC条件下表现最大酶活,在pH 4-8的范围内4 oC放置24 h能保持70%的酶活,60 oC下保温4 h能保持81%的残余酶活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 功能性甜味剂
• 1.2 双果糖酐Ⅲ
• 1.2.1 双果糖酐Ⅲ 的结构和理化性质
• 1.2.2 双果糖酐Ⅲ 的安全性
• 1.2.3 双果糖酐Ⅲ 功能性质
• 1.2.4 双果糖酐合成策略
• 1.2.5 双果糖酐Ⅲ 国内外生产现状
• 1.3 菊糖果糖转移酶的研究进展
• 1.3.1 菊粉酶与菊糖果糖转移酶的概述
• 1.3.2 菊糖果糖转移酶的微生物来源
• 1.3.3 菊糖果糖转移酶的分离纯化
• 1.3.4 菊糖果糖转移酶的酶学性质
• 1.3.5 菊糖果糖转移酶基因工程研究进展
• 1.3.6 菊糖果糖转移酶催化反应机理
• 1.4 本课题立题依据及意义
• 1.5 本课题研究思路与主要内容
• 参考文献
• 第二章 菊糖果糖转移酶产生菌的分离、筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 样品采集
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 菌种富集
• 2.2.6 菌种初筛
• 2.2.7 菌种复筛
• 2.2.8 菌株细胞形态观察
• 2.2.9 菌株的生理、生化特性鉴定
• 2.2.10 菌株的165 rDNA 序列分析
• 2.2.11 双果糖酐Ⅲ 的检测方法
• 2.2.12 菊糖果糖转移酶酶活测定
• 2.2.13 产物鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌种初筛
• 2.3.2 菌种复筛
• 2.3.3 细胞形态观察
• 2.3.4 菌株SK8.001 的生理生化特征
• 2.3.5 SK8.001 165 rDNA 序列测定
• 2.3.6 LC-MS-MS 鉴定
• C-NMR 鉴定'>2.3.7 （13） ^C-NMR 鉴定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 双果糖酐Ⅲ 的分离纯化及菊糖果糖转移酶的诱导合成
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 双果糖酐Ⅲ 的酶法合成
• 3.2.4 双果糖酐Ⅲ 糖液的热稳定性
• 3.2.5 离子交换树脂分离纯化糖液
• 3.2.6 双果糖酐Ⅲ 与低聚果糖分离度的定义
• 3.2.7 培养基
• 3.2.8 碳源诱导合成菊糖果糖转移酶
• 3.2.9 糖液组分分析
• 3.2.10 发酵过程参数测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 糖液组分分析
• 3.3.2 糖液热稳定性
• 3.3.3 糖液的离子交换树脂分离
• 3.3.4 有效诱导碳源的筛选
• 3.3.5 菊糖对A. aurescens SK 8.001 诱导合成菊糖果糖转移酶的影响
• 3.3.6 双果糖酐Ⅲ 对A. aurescens SK 8.001 诱导合成菊糖果糖转移酶的影响
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 A. aurescens SK8.001 菊糖果糖转移酶的分离纯化及酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 菊糖果糖转移酶的分离纯化过程
• 4.2.4 粗酶的制备过程
• 4.2.5 乙醇分级沉淀
• 4.2.6 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析
• 4.2.7 Superdex 200（10/300 GL）凝胶过滤层析
• 4.2.8 菊糖果糖转移酶分子量测定
• 4.2.9 pH 对酶活力及稳定性的影响
• 4.2.10 温度对酶活力及稳定性的影响
• 4.2.11 化学修饰剂对酶活力的影响
• 4.2.12 金属离子对酶活力的影响
• 4.2.13 动力学参数测定
• 4.2.14 底物研究
• 4.2.15 N-端结构测定
• 4.2.16 蛋白质含量测定
• 4.2.17 菊糖果糖转移酶酶活定义及测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 乙醇分级沉淀
• 4.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换色谱
• 4.3.3 Superdex 200（10/300 GL）凝胶过滤
• 4.3.4 菊糖果糖转移酶分子量测定
• 4.3.5 pH 对酶活力及稳定性的影响
• 4.3.6 温度对酶活力及稳定性的影响
• 4.3.7 化学修饰剂对酶活力的影响
• 4.3.8 金属离子及其它抑制剂对酶活的影响
• 4.3.9 动力学参数测定
• 4.3.10 酶底物研究
• 4.3.11 N-端结构测定
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 A. aurescens SK8.001 菊糖果糖转移酶基因的克隆表达及酶学性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种与质粒
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 培养基
• 5.2.5 菊糖果糖转移酶基因的克隆
• 5.2.6 菊糖果糖转移酶基因在大肠杆菌中的表达
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 菊糖果糖转移酶基因ift 的PCR 扩增
• 5.3.2 克隆载体pMD-ift-W、pMD-ift-In、pMD-ift-P 的构建
• 5.3.3 A. aurescens SK 8.001 菊糖果糖转移酶基因测序
• 5.3.4 菊糖果糖转移酶表达载体的构建
• 5.3.5 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 5.3.6 信号肽对产酶活的影响
• 5.3.7 BL21（pET226-ift-W） 菊糖果糖转移酶的发酵过程
• 5.3.8 重组菊糖果糖转移酶酶学性质研究
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 论文主要结论
• 论文创新点
• 附录：N-端结构分析图谱及标准氨基酸分析图谱
• 致谢
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文