猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

论文摘要

2006年6月,我国的南方（华东、华中）几个省份猪群发生了一种以高热（体温41～42℃）,稽留不退、厌食、呼吸困难、嗜睡等为主要症状的传染病,此次流行的疾病以传播速度快、死亡率高、治愈率低为特征。发病率在30～70%,死亡率在30～50%,部分猪场在100%,通过农业部组织有关单位开展流行病学调查、病原分离鉴定、动物试验等科技攻关,证实了此次疫情主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起。另外,其他病原体如猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、大肠杆菌、巴氏杆菌、附红细胞体、弓形虫等的感染加重了病情。对于猪繁殖与呼吸综合征的诊断方法,有病毒分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、血清病毒中和试验（SVN）、乳胶凝集试验（LAT）、间接ELISA等。前4种检测方法需要细胞培养,耗时长等缺点,不能满足流行病学调查需要。为了更快速地对猪高致病性蓝耳病进行诊断,本研究主要进行了以下工作:1.根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因组序列中的ORF7末端序列设计了一对特异性的引物P1/P2,扩增的片段为535 bp,建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR的快速诊断方法。特异性试验表明,这1对引物不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。重复性和敏感性试验表明,本方法可重复性强,可以检测到10-4TCID50的病毒含量,提高了病毒的检出率和准确性,尤其是对于早期感染、潜伏期感染和持续性感染的诊断均具有重要的意义。此法在临床上可应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断和分子流行病学调查研究。2.对河南省周口、郑州及开封等地区的发病猪群进行了临床症状和病理观察,采集疑似猪高致病性蓝耳病的病料,采用已建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR快速检测方法进行检测,并对部分扩增序列进行了序列测定和分析。结果表明,24份待检病料中,16份扩增出了特异性的目的条带。部分目的片断经克隆、测序及序列分析发现,流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒属于美洲型。通过与美洲型的PRRSV代表株（ATCC-VR-2332）全基因组序列进行比对发现,在此534bp目的片断区域存在较多的散在点突变。推导的N蛋白的氨基酸序列在11aa、15aa和46aa存在点突变。本研究为更好地预防和控制猪繁殖与呼吸综合征的发生和流行提供了技术支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
• 1.1 病原学
• 1.1.1 PRRSV 的分类地位
• 1.1.2 PRRSV 的一般特性
• 1.1.3 PRRSV 基因组结构与功能
• 1.1.4 病毒基因组的转录及表达
• 1.1.5 病毒主要结构蛋白
• 1.1.6 病毒主要非结构蛋白
• 1.1.7 PRRSV 基因组变异
• 1.2 流行病学
• 1.3 发病机制
• 1.4 临床症状及病理变化
• 1.4.1 临床症状
• 1.4.2 病理变化
• 1.5 PRRSV 免疫学研究
• 1.5.1 体液免疫
• 1.5.2 细胞免疫
• 1.5.3 抗体依赖性增强作用（ADE）
• 1.6 PRRS 诊断技术研究
• 1.6.1 临床诊断
• 1.6.2 病毒分离
• 1.6.3 血清学检测
• 1.6.4 分子生物学实验方法
• 1.7 防制技术研究
• 1.8 结语
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR 检测方法的建立及应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 病料及参考毒株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 病料的处理
• 2.2.2 引物的设计
• 2.2.3 总RNA 的提取及cDNA 的制备
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 PCR 扩增产物的凝胶电泳
• 2.2.6 RT-PCR 检测方法的特异性、敏感性、重复性试验
• 2.2.7 RT-PCR 方法的应用
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-PCR 扩增
• 2.3.2 引物特异性试验
• 2.3.3 引物敏感性试验
• 2.3.4 重复性试验
• 2.3.5 临床样品的检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于本方法特异性
• 2.4.2 关于本方法敏感性及重复性
• 2.4.3 临床应用
• 2.5 小结
• 第三章 河南省猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR 检测及防治措施
• 3.1 流行情况
• 3.2 临床症状
• 3.3 病理变化
• 3.4 材料与方法
• 3.4.1 病料的采集与处理
• 3.4.2 载体及菌种
• 3.4.3 酶与试剂
• 3.4.4 引物设计
• 3.4.5 病毒RNA 提取及RT-PCR
• 3.4.6 部分PCR 扩增产物的回收
• 3.4.7 目的片段与载体的连接
• 3.4.8 感受态细胞的制备
• 3.4.9 连接产物的转化
• 3.4.10 碱裂解法小量提取质粒
• 3.4.11 重组质粒的鉴定
• 3.4.12 部分阳性质粒的序列测定
• 3.5 结果
• 3.5.1 疑似高致病性蓝耳病样品RT-PCR 扩增
• 3.5.2 部分扩增产物重组质粒的酶切鉴定
• 3.5.3 阳性质粒的序列测定结果
• 3.5.4 目的片断的序列分析
• 3.6 讨论
• 3.6.1 病因分析
• 3.6.2 RT-PCR 扩增
• 3.6.3 防制策略
• 3.6.4 防治措施
• 3.7 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介