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拟南芥微丝结合蛋白Profilin3体内生理功能研究

2020-12-10阅读(284)

拟南芥微丝结合蛋白Profilin3体内生理功能研究

论文摘要

微丝骨架是存在于所有真核细胞中高度动态变化的三维网状结构,不仅为细胞提供内在的机械支持,同时也参与了许多重要的细胞过程。微丝骨架这些功能的实现既依赖于微丝骨架自身的组织结构,又依赖于微丝结合蛋白（actin binding proteins, ABPs）和不同信号分子调节的微丝骨架动态变化。植物细胞中,许多ABPs已被发现并证明参与不同的生理功能。Profilin是真核生物中发现较早,高度保守且表达量较多的一类ABPs。拟南芥基因组中有5个高度保守的profilin异型体。目前对于该家族成员的生化功能有较多的报道,而对于其体内生理功能的研究却非常匮乏。Profilin3（PRF3）是一个组成型表达的profilin基因,与拟南芥其他profilin基因相比,该基因的N末端多了36个氨基酸残基,而其生理生化功能则完全未知。因此,本研究首次系统的研究了PRF3的组织定位、生理功能等内容,并得到了以下结论：1.PRF3是一类组成型表达的profilin异型体。通过GUS活性分析和荧光定量PCR的方法证实PRF3主要在幼苗,莲座叶和茎生叶中表达,在14天的小苗和花中的表达量很少,并且该基因的内含子可能增强基因的表达。这一结果揭示了PRF3的组织表达特征。2.体外生化功能表明PRF3增加actin聚合的临界浓度,并且PRF3-ΔN36的Cc值最大,对actin聚合的影响最明显,而PRF3的Cc值介于PRF3-ΔN36和actin之间。这说明了PRF3的N端36个氨基酸与其蛋白功能有密切的关系。3.与野生型拟南芥相比,过表达全长PRF3的cDNA序列的转基因植株缩短小苗的根长,下胚轴和根毛的长度,延迟种子的萌发,但是PRF3-ΔN36转基因植株和pf3突变体没有明显的表型。这一结果说明PRF3是根,下胚轴和根毛生长的重要的负调节因子,并且只有当基因完整时才具有这种功能。4.光学显微镜和扫描电镜的观察结果显示OE-PRF3植株的下胚轴细胞的长度明显较短,细胞伸长受到抑制,说明PRF3与下胚轴细胞的伸长有着密切的关系。5.激光共聚焦扫描显微镜观察发现OE-PRF3过表达植株的下胚轴细胞中粗的微丝束消失,但是细的微丝依然存在没有明显的变化,说明过表达PRF3全长基因能够引发微丝发束解聚,造成F-actin的重组,而粗的微丝束结构可能与细胞伸长密切相关。6.通过对温度胁迫引发的微丝骨架组织结构的重组进行了观察发现微丝骨架的组织结构参与响应植株的温度胁迫。低温处理下微丝骨架发生重组,并有部分解聚；而高温处理下微丝骨架发生重组。7.不同温度处理条件下,促进微丝聚合的药物phalloidin能够增加拟南芥小苗的温度耐受性,而抑制微丝聚合的药物latrunculin B降低植株的温度耐受性。这一结果说明微丝骨架参与植物对温度胁迫的响应。8.荧光定量PCR的结果证实了非生物胁迫诱导大部分组成型表达的profilin和ADF表达,并且某些特定基因响应特定的环境胁迫,如ADF6只有在热激胁迫下表达量才明显升高。这一结果揭示了非生物胁迫影响这些基因转录水平的变化,而这种变化证明同基因响应同一非生物胁迫的方式不同,而不同非生物胁迫下同一基因的响应方式也不同。综上所述,本研究发现PRF3在拟南芥幼苗期的生长发育发挥重要的生理功能,对根,根毛,下胚轴的生长有负调节作用,过表达PRF3引起的矮化表型可能是由微丝骨架重组造成的,特别是纵向微丝束的减少甚至消失。体外实验也证明了PRF3的N端特异的36个氨基酸可能与PRF3的生理功能密切相关。此外,本研究证明了微丝骨架参与植物抵御温度胁迫,同时荧光定量PCR的结果为研究ABPs在非生物胁迫中的功能提供了详实的理论依据。本研究为进一步研究植物微丝骨架及其结合蛋白的体内生理功能奠定了理论基础,为揭示植物响应非生物胁迫的机制研究提供了科学依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 縮写词表
  • 第一章 文献综述
  • 1. 微丝骨架简介
  • 2. 植物微丝骨架的功能研究进展
  • 2.1 微丝骨架与环境胁迫的关系
  • 2.2 微丝骨架与信号转导的关系
  • 2.3 微丝骨架与细胞伸长的关系
  • 3. 肌动蛋白结合蛋白（ABPs）的研究进展
  • 3.1 肌动蛋白结合蛋白-Profilin的研究进展
  • 3.1.1 Profilin的结构特征
  • 3.1.2 Profilin的异型体
  • 3.1.3 Profilin对微丝的调节作用
  • 3.1.4 Profilin在信号传导中的功能研究
  • 3.1.5 Profilin的分布及生理功能
  • 3.2 肌动蛋白结合蛋白-ADF/confilin的研究进展
  • 3.2.1 ADF/confilin的基本结构特征
  • 3.2.2 ADF/confilin的异型体
  • 3.2.3 ADF/confilin对微丝的调节作用
  • 3.2.4 ADF/confilin的活性调节及其参与的信号通路
  • 3.2.5 ADF/confilin的生理功能
  • 4. 本研究的目的及意义
  • 第二章 拟南芥中过表达PRF3影响下胚轴细胞的伸长和微丝骨架结构
  • 1. 实验材料
  • 2. 实验方法
  • 2.1 植物材料的培养
  • 2.2 转基因株系PRF3pro::GUS和PRF3pro::G::GUS的获得与GUS染色及活性检测
  • 2.3 real-time PCR
  • 2.4 基因克隆与重组蛋白表达载体构建
  • 2.5 重组蛋白的表达与纯化
  • 2.6 肌动蛋白的提取与纯化
  • 2.7 荧光光谱测定actin聚合的临界浓度
  • 2.8 过表达转基因植株的构建及筛选
  • 2.9 PRF3突变体植株prf3的纯合体鉴定
  • 2.10 PRF3插入突变体植株和过表达植株的RT-PCR
  • 2.11 PRF3插入突变体植株和过表达植株的表型观察
  • 2.12 下胚轴细胞的观察
  • 2.13 下胚轴细胞内微丝骨架结构的观察
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 拟南芥PRF3基因的遗传特征
  • 3.2 拟南芥PRF3的组织表达模式
  • 3.3 PRF3与G-actin的亲和性分析
  • 3.4 T-DNA插入突变体和过表达植株的表型分析
  • 3.5 过表达PRF3对下胚轴细胞形态的影响
  • 3.6 过表达PRF3导致下胚轴细胞中F-actin组织结构重组
  • 4. 讨论
  • 4.1 拟南芥PRF3是一种组成型profilin基因并且能够增加Cc
  • 4.2 过表达全长PRF3的cDNA序列通过调节微丝束的解聚抑制细胞伸长
  • 第三章 微丝骨架参与响应温度胁迫
  • 1. 实验材料
  • 2. 实验方法
  • 2.1 植物材料的培养
  • 2.2 温度胁迫对拟南芥小苗生长的影响
  • 2.3 微丝药物对温度胁迫的影响
  • 2.4 下胚轴细胞的观察
  • 2.5 微丝结构的观察
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 低温胁迫抑制拟南芥小苗的生长
  • 3.2 低温处理影响下胚轴细胞中微丝的重组
  • 3.3 高温胁迫影响拟南芥小苗的存活
  • 3.4 高温处理引起下胚轴细胞中微丝的重排
  • 3.5 微丝重组参与植物低温胁迫耐受性的获得
  • 3.6 微丝重组参与植物高温胁迫耐受性的获得
  • 4. 讨论
  • 第四章 非生物胁迫影响拟南芥组成型profilin和ADF的转录水平
  • 1. 实验材料
  • 2. 实验方法
  • 2.1 不同胁迫处理
  • 2.2 总RNA的提取及反转录
  • 2.3 荧光实时定量PCR（real-time PCR）
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 温度胁迫下组成型profilin的表达谱
  • 3.2 温度胁迫下组成型ADF的表达模式
  • 3.3 干旱和盐胁迫下组成型profilin的差异表达
  • 3.4 干旱和盐胁迫对组成型ADF基因表达模式的调节
  • 4. 讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 在学期间发表论文情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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