重组MUC1融合蛋白的制备及检测MUC1双抗体夹心ELISA方法的建立

论文摘要

MUC1粘蛋白因其在多种腺癌包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌等细胞上的高度异常表达使其成为肿瘤诊断和治疗的有效靶点。研究发现,腺癌患者尤其乳腺癌患者外周血中MUC1的水平较正常人高。其水平升高可以作为肿瘤辅助诊断指标。但目前因方法各异,在临床上尚未形成一种成熟的敏感特异的技术手段,而国外研发商业化生产的双抗体夹心ELISA法（CASA test）对腺癌的检出阳性率较低。本研究为检测肿瘤患者外周血中MUC1蛋白水平,建立一种更加敏感的双抗体夹心ELISA技术。首先构建pGEX- MUC1和pMAL-MUC1两种表达载体,转化大肠杆菌,通过IPTG诱导MUC1-GST及MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达;经Glutathione Sepharose 4B亲和层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化MUC1-GST融合蛋白,通过Amylose Resin亲和层析纯化MUC1-MBP融合蛋白,经Western blot鉴定蛋白的正确性;然后,将纯化的MUC1-GST和MUC1-MBP融合蛋白分别免疫家兔和大鼠,制备两种抗人MUC1多克隆抗体。最后,通过不同组合筛选合适的一级抗体、二级抗体及标准品,建立MUC1蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,采用双抗体夹心ELISA方法检测乳腺癌患者血清中MUC1蛋白含量。本研究所建立的双抗体夹心ELISA检测血清中MUC1的方法,具有简便、快捷、敏感性强及检出率高等优点,可望发展成为临床上检测腺癌的一种常规试剂盒。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 第一章 文献回顾
• 1 MUC1 的特点
• 1.1 Mucin家族
• 1.2 MUC1 分布
• 1.3 MUC1 基因与MUC1 蛋白
• 1.4 MUC1 同种型
• 2 MUC1 生物学功能
• 2.1 MUC1 介导细胞间的相互作用
• 2.2 MUC1 在信号传导中的作用
• 2.3 MUC1 在肿瘤发生发展中的作用
• 2.4 MUC1 通过各种途径参与肿瘤侵袭和转移
• 3 外周血MUC1 的检测
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 细胞、质粒与菌株
• 1.2 酶、抗体及其它试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 电泳试剂
• 1.5 Western blot 相关试剂
• 1.6 纯化蛋白试剂
• 1.7 免疫活性测定的相关试剂
• 2 实验方法
• 2.1 pGEX- MUC1 表达载体的构建
• 2.2 重组质粒pGEX- MUC1转化大肠杆菌BL21
• 2.3 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.4 重组 MUC1 融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达
• 2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.6 Western blot
• 2.7 重组人 MUC1 融合蛋白的纯化
• 2.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化重组 MUC1 融合蛋白
• 2.9 动物免疫
• 2.10 ELISA 检测动物血清中抗MUC1 抗体效价
• 2.11 免疫血清的分离及抗MUC1 多克隆抗体的纯化
• 2.12 MUC1 蛋白双抗体夹心ELISA 检测方法的建立
• 2.13 双抗体夹心法检测乳腺癌患者血清中MUC1
• 第三章 实验结果
• 1 pGEX- MUC1 表达载体的成功构建
• 2 重组MUC1-GST 融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达
• 3 重组人 MUC1 融合蛋白的鉴定
• 4 重组MUC1-GST 及MUC1-MBP 融合蛋白的纯化
• 5 重组人MUC1 融合蛋白免疫动物诱导产生抗MUC1 特异性多克隆抗体
• 6 成功建立MUC1 蛋白双抗体夹心ELISA 检测方法
• 7 双抗体夹心ELISA 方法检测乳腺癌患者血清中MUC1蛋白水平
• 第四章 讨论
• 1 重组人MUC1-GST 和MUC1-MBP 融合蛋白的制备
• 2 兔抗人MUC1 多克隆抗体及大鼠抗人MUC1多克隆抗体的制备
• 3 建立双抗体夹心ELISA 试剂盒最佳条件的选择
• 4 双抗体夹心ELISA 检测结果的综合分析
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢