抗花叶病烟草种质资源的筛选

论文摘要

本研究以不同类型的3种烟草种质为试验材料,采用ISSR分子标记的方法对地方烤烟、地方晒烟、选育烤烟等3种烟草种质的遗传多样性和亲缘关系进行研究,并且通过分子鉴定和田间鉴定的方法对其花叶病抗性进行鉴定研究,为筛选抗病烟草种质奠定基础。最后,以感病品种有梅密目、中抗品种龙岩C2和抗病品种永定400这三种不同抗性的烟草品种为材料,用半定量RT-PCR的方法对抗花叶病基因（cn）的时空表达进行检测研究,为烟草花叶病早期的诊断和防治提供理论依据。主要研究结果如下：1、3种烟草种质遗传多样性和亲缘关系的分析研究用100条ISSR引物筛选出24条多态性引物（占24%）,总共扩增出192条DNA谱带,其中多态性谱带141条,平均多态性比率为73.4%。通过DPS软件分析3种烟草种质的ISSR统计数据可获得以下结果：3种烟草种质的遗传相似系数（GS）范围为0.1258-0.5294,说明3种烟草种质的遗传多样性比较丰富,存在明显的遗传差异性,具有较宽的遗传基础。在聚类分析过程中,一些亲缘关系较近的烟草种质会聚成一个大类；同一类型的烟草种质如果遗传差异较大不一定聚到一起；亲缘关系相近的烟草种质出现交叉聚类的现象。2、3种烟草种质花叶病抗性的鉴定研究分子鉴定结果如下：根据GenBank上登录的抗花叶病基因（cn）的核苷酸保守序列设计一对特异引物对3种烟草种质的基因组DNA进行PCR扩增,共检测出36条抗病谱带,并回收纯化PCR产物进行测序分析,其核苷酸保守序列与其它抗花叶病基因的保守序列具有较高的同源性,达到88%。田间鉴定结果如下：用TMV接种3种烟草种质的健康植株可鉴定出不同烟草种质表现的抗病结果不同,其中有抗TMV烟草种质4个,感TMV烟草种质3个,中抗TMV烟草种质25个,中感TMV烟草种质14个。将分子鉴定结果和田间鉴定结果对比分析后得出田间鉴定结果与分子鉴定结果一致的烟草种质28个,占烟草种质总数的60.9%。另外,前人未进行花叶病抗性鉴定研究的烟草种质24个,其中有16个烟草种质的田间鉴定结果与分子鉴定结果一致,占这24个新鉴定出抗病结果的烟草种质的66.7%。3、抗花叶病基因（cn）的时空表达研究用改良的TRIzol法提取的总RNA不仅完整性好,质量也好,是提取烟草叶片等组织总RNA行之有效的方法。根据GenBank上登录的烟草看家基因actin （actin作为内参照）和抗花叶病基因（cn）核苷酸保守序列设计特异引物进行半定量RT-PCR反应,检测出接种TMV后抗花叶病基因（cn）于不同处理时间和不同抗性烟草品种里的表达情况不同,其中感病品种有梅密目（A9）在烟草叶片开始表现花叶症状的第10天,抗花叶病基因的表达量最高；中抗品种龙岩C2（C17）在烟草叶片开始表现花叶症状的第2天,抗花叶病基因的表达量最高；抗病品种永定400（C5）在烟草叶片开始表现花叶症状的第10天,抗花叶病基因的表达量最高。本研究对3种烟草种质的遗传多样性、亲缘关系、花叶病抗性及抗花叶病基因的时空表达情况等进行了研究,在抗花叶病烟草品种的鉴定和筛选上具有重要参考价值,也为培育用于烟草生产的抗花叶病品种奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 烟草种质资源研究进展
• 1.1 我国烟草种质资源的现状
• 1.2 抗病烟草种质资源的研究概况
• 1.3 烟草种质资源鉴定方法的研究概况
• 1.3.1 直接鉴定和间接鉴定法
• 1.3.2 自然鉴定和诱发鉴定法
• 1.3.3 当地鉴定和异地鉴定法
• 2 分子标记在烟草研究中的应用
• 2.1 分子标记的概述
• 2.2 分子标记在烟草研究中的应用
• 2.2.1 RAPD分子标记在烟草研究中的应用
• 2.2.2 AFLP分子标记在烟草研究中的应用
• 2.2.3 ISSR分子标记在烟草研究中的应用
• 3 抗烟草花叶病基因工程的研究进展
• 3.1 植物抗花叶病基因的应用
• 3.2 烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因的研究进展
• 3.3 烟草花叶病毒（TMV）复制酶基因的研究进展
• 3.4 突变烟草花叶病毒（TMV）运动蛋白基因的研究进展
• 3.5 RNA干扰技术的应用
• 4 本研究的目的意义
• 第二章 烟草种质资源遗传多样性和亲缘关系的ISSR分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试植物材料
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 烟草基因组DNA的提取、纯化和检测
• 1.2.3 ISSR PCR反应
• 1.2.4 电泳检测
• 1.2.5 相似系数和聚类分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ISSR引物的筛选
• 2.2 ISSR反应体系的优化
• 2.3 ISSR遗传多样性分析
• 3 讨论
• 3.1 ISSR分子标记法分析烟草基因组DNA的多态性与稳定性
• 3.2 ISSR分子标记法分析烟草种质的亲缘关系
• 第三章 不同烟草种质花叶病抗性分子鉴定与田间鉴定的比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 烟草种质花叶病抗性的分子鉴定分析
• 1.1.1.1 供试植物材料
• 1.1.1.2 供试菌种
• 1.1.1.3 引物设计
• 1.1.1.4 主要分子生物学及生化试剂
• 1.1.1.5 主要仪器设备
• 1.1.2 烟草种质花叶病抗性的田间鉴定分析
• 1.1.2.1 供试植物材料
• 1.1.2.2 供试病毒源
• 1.1.2.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 烟草种质花叶病抗性的分子鉴定分析
• 1.2.1.1 烟草基因组DNA的提取、纯化和检测
• 1.2.1.2 PCR扩增反应
• 1.2.1.3 回收PCR产物
• 1.2.1.4 制备大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.1.5 连接目的片段
• 1.2.1.6 转化大肠杆菌
• 1.2.1.7 提取重组子质粒DNA
• 1.2.1.8 重组质粒DNA的PCR鉴定
• 1.2.1.9 测定目的片段的序列
• 1.2.1.10 烟草抗花叶病基因目的片段的序列分析
• 1.2.2 烟草种质花叶病抗性的田间鉴定分析
• 1.2.2.1 试验设计
• 1.2.2.2 汁液摩擦接种诱发
• 1.2.2.3 烟草普通花叶病的田间调查
• 1.2.2.4 烟草普通花叶病的病害严重度分级
• 1.2.2.5 烟草普通花叶病的抗性分级
• 2 结果与分析
• 2.1 烟草种质花叶病抗性的分子鉴定结果与分析
• 2.1.1 烟草抗花叶病基因（cn）目的片段的获得
• 2.1.2 目的片段的回收与鉴定
• 2.1.3 cn基因核苷酸序列的分析
• 2.1.4 烟草抗花叶病基因（cn）的进化分析
• 2.2 烟草种质花叶病抗性的田间鉴定结果与分析
• 2.3 烟草种质花叶病抗性的分子鉴定与田间鉴定结果的对比分析
• 3 讨论
• 第四章 半定量RT-PCR法检测抗烟草花叶病基因的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 引物设计
• 1.1.3 主要分子生物学及生化试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 提取烟草总RNA
• 1.2.3 合成cDNA第一链
• 1.2.4 烟草抗花叶病基因的PCR扩增
• 1.2.5 电泳检测
• 2 结果与分析
• 2.1 烟草总RNA的提取与电泳检测
• 2.2 接种TMV后烟草抗花叶病基因于不同处理时间的表达
• 3 讨论
• 第五章 本研究的主要结论
• 参考文献
• 附录1 部分试剂配方
• 附录2 缩略词
• 致谢