纤维素酶水解壳聚糖的特性及机理研究

论文摘要

国内外报道表明,纤维素酶能非专一性地水解壳聚糖,由于价格低廉,目前已替代甲壳素酶和壳聚糖酶广泛应用于甲壳聚低聚糖的生产。但其水解壳聚糖的作用是由于纤维素酶中的杂质还是纤维素酶本身引起、纤维素酶水解壳聚糖的作用方式和水解机理等方面仍不清楚。因此有必要深入探讨纤维素酶对壳聚糖水解的特性和规律,从而了解酶解机理。本论文的研究,对于进一步阐明非专一性酶水解壳聚糖的作用机理具有重要的学术意义,同时对于酶法生产甲壳低聚糖具有重要的应用价值。本论文首先对四种商品纤维素酶水解壳聚糖的活性进行比较,从中筛选出一种水解壳聚糖活性最高的绿色木霉产纤维素酶。其水解壳聚糖的最适作用温度为60℃、最适作用pH为5.2;水解羧甲基纤维素的最适作用温度为55℃、最适作用pH为4.2。在纤维素酶水解壳聚糖的最适条件下,运用粘度法、TCL法及还原糖法等对纤维素酶水解壳聚糖的特性进行研究,结果表明壳聚糖经纤维素酶水解10min,溶液粘度下降54.5%;壳聚糖的水解反应速率与底物的脱乙酰度及底物的粘均分子量之间关系不显著;不同脱乙酰度的壳聚糖的水解产物基本一致,初期以甲壳四糖、甲壳五糖、甲壳六糖等为主,随着时间的延长,有少量甲壳二糖、单糖产生,表明纤维素酶中含有内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶等多种酶。采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Sephadex G-75凝胶层析等方法从纤维素酶中分离纯化得到一种既具有壳聚糖酶活性又具有纤维素酶活性的酶组分CCBE,采用RP-HPLC、SDS-PAGE经银染、IEF等工作原理不同的三种方法鉴定其为一种纯酶组份。经测定CCBE相对分子质量为66,000,等电点pI接近4.45。运用还原糖含量的测定方法,对CCBE的水解壳聚糖的酶学性质进行研究,结果表明,CCBE水解脱乙酰度90%壳聚糖的最适作用温度为60℃、最适pH为5.2; Km = 0.746 mg GlcN/mL,Vmax = 0.0268 mg/mL·min;CCBE的水解壳聚糖活性在30℃～40℃之间非常稳定,50℃作用60 min相对残余酶活略有下降,60℃作用30 min其相对残余酶活下降为60%,70℃和80℃作用30 min,相对残余酶活急剧下降;其壳聚糖酶活性在pH 4.0～7.8之间较为稳定。对CCBE水解羧甲基纤维素的酶学性质研究表明,其最适作用温度为55℃、最适pH为4.2,Km = 4. 078 mgGlu/mL ,Vmax = 0.127 mg葡萄糖/mL·min;其羧甲基纤维素酶活性在30℃～50℃之间非常稳定,60℃作用30 min其相对残余酶活保留84 %。70℃和80℃作用30 min,相对残余酶活急剧下降,其纤维素酶活性在pH 4.0～6.0之间较为稳定,表明CCBE水解壳聚糖和纤维素两种不同底物时酶学性质有较大差异。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景和意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.3 课题的研究内容
• 参考文献
• 第二章 纤维素酶水解壳聚糖的酶学特性研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与设备
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 纤维素酶中具有壳聚糖酶活性组分的分离纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与设备
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.5 本章小节
• 参考文献
• 第四章 CCBE水解壳聚糖的作用模式研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与设备
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 纤维素酶中CCBE的化学修饰和活性中心
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 主要创新点
• 展望
• 致谢
• 发表的与博士论文相关的文章