论文摘要
肌抑素（myostatin,又名GDF-8）,为转化生长因子-beta（TGF-β）超家族成员之一,其功能是负向调控骨骼肌的生长和发育。随着研究的深入myostatin基因的一些新功能被逐渐发现,其在肌肉的发生、生长发育、再生、萎缩和退化等过程中均扮演着重要角色,日益显现出该基因在功能上的重要性。为进一步研究myostatin基因在胚胎发生和体内骨骼肌发育中的功能作用和机制,本研究以鸡为研究对象,分别在体外和体内对myostatin进行了功能研究和结构分析,获得了较好的实验结果。具体过程如下:逆转录病毒介导法建立转基因鸡技术平台:即将标记基因（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）克隆到逆转录病毒表达载体,以phoenix或HEK293T细胞进行泛嗜性VSV-G（水泡性口炎病毒囊膜蛋白）病毒包装,并用包装病毒体外侵染原代鸡胚胎成肌细胞（Chicken Embryonic Myoblasts,CEM）检测病毒侵染效率、整合及转录活性,然后大量包装病毒并超离浓缩后,将浓缩病毒进行新生种蛋胚盘下腔接种,分别对接毒5天发育全胚和新生雏鸡的不同脏器进行基因组PCR鉴定分析。结果表明:包装的逆转录病毒在体外具有侵染和转录活性;体内鉴定分析显示标记基因EGFP已整合到5天鸡胚和一只雏鸡的胸腺和皮肤组织基因组中,表明制备嵌合型GFP转基因鸡的技术平台基本建立。Myostatin基因在鸡胚胎发育早期的功能初探:即针对鸡myostatin基因编码序列设计四条靶片段（19bp）,并将其克隆到RNAi逆转录病毒表达载体pSIREN-RetroQ中,体外分析表明RNAi能封闭靶基因myostatin的转录活性。利用转基因鸡技术平台,大量包装泛嗜性RNAi逆转录病毒,将浓缩病毒进行新生种蛋胚盘下腔接种,回收5天接毒发育鸡胚进行全胚半定量分析。结果表明:重组RNAi病毒能够下调5天胚胎myostatin的表达,并诱导MyoD和myogenin两基因表达明显上调,P21表达下调,促进myostatin下调组织部位的肌肉发生。另原位杂交分析表明:myostatin在胚胎不同组织部位表达量存在差异,在脑和眼等部位高表达,说明myostatin在鸡胚胎早期发育中可能还具有其他重要作用。Myostatin基因在雏鸡胸肌发育中的功能初探:将包装浓缩后的RNAi病毒和RNAi重组质粒分别梯度接种0天雏鸡的胸肌,并以PBS接种组雏鸡为对照,饲养10天后宰杀雏鸡观察胸肌表型变化,提取各组雏鸡胸肌组织RNA和蛋白进行分析。结果表明:胸肌接种myostatin的RNAi重组病毒或质粒后,能够封闭靶基因myostatin的表达,诱导MyoD、myogenin、Pax7和mIGF-1的转录水平上调和P21下调。RNAi接种组雏鸡表现出胸肌丰满肥厚,肌纤维肥大,肌纤维内细胞核增多。鸡myostatin基因启动子活性分析:为深入理解myostatin基因的表达调控机制,本实验克隆了肉鸡和蛋鸡5’端调控区2.0kb片段,序列分析表明不同种属动物myostatin基因启动子间保守性较高,而且在肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子区域也保守地存在着多个CAAT盒和E盒。此外,在其他种属动物如牛、猪、羊等myostatin基因启动子上的一些肌肉生长反应元件在肉鸡和蛋鸡中也同样保守存在。根据肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间的SNP位点的不同,设计了肉鸡和蛋鸡六个不同长度的启动子片段并克隆到pGL3-Basic载体中,将重组载体分别转染和相互转染肉鸡和蛋鸡胚胎成肌细胞（CEM）,通过Luciferase Assay System和β-Galactosidase Enzyme Assay System两检测系统相结合,利用缺失分析的方法来比较肉鸡和蛋鸡启动子活性及差异。结果表明:肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间转录活性存在差异,其中肉鸡和蛋鸡在0.2kb片段处活性差异较大。肉鸡和蛋鸡启动子在各自细胞中活性均较高,但相比较而言蛋鸡细胞环境更适于myostatin基因的转录。突变分析表明:0.2kb片段的-19bp SNP位点为该片段在肉鸡和蛋鸡间活性差异的关键位点。总之,肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间确实存在转录活性差异,而这种转录活性差异与肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间的SNP位点的存在和肉鸡和蛋鸡不同的细胞内环境有关。通过以上分析表明:转基因鸡技术平台与RNAi技术相结合的方法来研究myostatin在鸡胚胎发育早期的作用和出生后骨骼肌增生中功能取得了较好效果,结果表明myostatin不但在鸡胚胎发育早期显著影响着肌肉发生和相关基因的表达变化,而且可能具有除参与肌肉发生外的其它作用,另在雏鸡体内骨骼肌生长发育中也起着重要作用。启动子分析表明:肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间存在活性差异,并且这种差异与细胞环境和启动子本身均有关。本实验在结构和功能两个方面对鸡myostatin基因进行了初步研究,希望能够为深入了解myostatin的功能和应用提供参考。