利用拟南芥油体系统表达重组人胰岛素的研究

论文摘要

糖尿病是一组以高血糖为特征的慢性、全身性代谢疾病,如果不尽早治疗,会发生严重的并发症。糖尿病发生的直接原因是胰岛素绝对或者相对不足。胰岛素是治疗糖尿病的重要药物,I型糖尿病依赖胰岛素来维持生命,II型糖尿病也经常需要使用胰岛素来控制血糖。随着糖尿病发病人数的增多,对胰岛素的需求量也越来越大。人胰岛素是由51个氨基酸残基组成的双链多肽。胰岛素产品来源包括最早的从动物胰腺提取的天然胰岛素,以及近年来利用大肠杆菌和酵母等微生物生产的重组人胰岛素等。在植物生物反应器中表达重组人胰岛素也有相关报道,但技术尚不成熟,不能进行大规模生产。本研究尝试以拟南芥为模式植物,利用植物油体表达系统生产重组人胰岛素。首先,用合成的小人胰岛素原基因（mins）构建了植物种子特异性表达载体op::og-mins-2300-twin。为了方便后期蛋白的检测和纯化,对其进行了突变,在mins的C肽中加入一段由7个组氨酸组成的histag,得到变异小人胰岛素基因（MF）,并构建了最终使用的植物种子特异性表达载体op::og-MF-2300-twin。然后,通过农杆菌介导的花粉管导入法侵染了拟南芥,得到8个能产生后代的独立阳性株系。最后,对转基因拟南芥进行了分子检测:1)DNA PCR和Southern杂交结果证明目的基因已经正确的插入到拟南芥基因组中,其中MF5株系中有2个基因拷贝,MF9株系中有5个基因拷贝。2)RT-PCR结果表明目的基因在拟南芥各个株系中都有转录,以MF9株系的转录量最高,而目的基因在转基因拟南芥的叶片中也有较弱的转录,可以进行进一步的研究。3)SDS-PAGE和Western杂交结果证明了目的蛋白在拟南芥种子中已经得到表达。本研究在已发表文献提供方法的基础上,总结和改进了在植物油体系统中表达重组人胰岛素的技术,并成功在拟南芥种子中进行了表达,得到含有油体蛋白-重组人胰岛素融合蛋白的拟南芥种子,可供进一步的纯化和活性实验使用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词中英文对照表
• 第一章 文献综述
• 1.1 糖尿病研究现状
• 1.1.1 糖尿病发病情况
• 1.1.2 糖尿病的发病机理和治疗方法概述
• 1.1.2.1 I 型糖尿病
• 1.1.2.2 II 型糖尿病
• 1.1.2.3 妊娠期糖尿病（GDM）
• 1.1.2.4 特异型糖尿病
• 1.2 胰岛素研究进展
• 1.2.1 胰岛素的结构和功能
• 1.2.2 胰岛素类药物的发展
• 1.2.3 基因工程技术表达重组人胰岛素的研究
• 1.3 油体表达系统概述
• 1.3.1 油体和油体蛋白
• 1.3.2 油体表达系统的特点和发展现状
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 细菌和植物培养基
• 2.1.4 生化试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 试剂盒和部分溶液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 油体-小人胰岛素原融合基因（oleosin-mins）植物表达载体构建
• 2.2.1.1 小人胰岛素原基因（mins）合成
• 2.2.1.2 pUC57-mins 和op::og-Tα4-2300-twin 质粒提取
• 2.2.1.3 pUC57-mins 和op::og-Tα4-2300-twin 质粒酶切
• 2.2.1.4 酶切片段回收
• 2.2.1.5 回收片段连接
• 2.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α
• 2.2.1.7 阳性克隆的挑选和PCR 鉴定
• 2.2.2 油体-变异小人胰岛素原融合基因（oleosin-MF）植物表达载体构建
• 2.2.2.1 用PCR 方法进行基因序列突变
• 2.2.2.2 回收PCR 产物并克隆到pUC57 载体上
• 2.2.2.3 通过亚克隆得到完整的变异小人胰岛素原基因（MF）
• 2.2.2.4 构建表达载体
• 2.2.3 双元表达载体转化根癌农杆菌GV3101
• 2.2.3.1 根癌农杆菌感受态的制备和转化
• 2.2.3.2 根癌农杆菌阳性克隆的鉴定
• 2.2.4 花浸染法转化拟南芥
• 2.2.4.1 拟南芥的栽培
• 2.2.4.2 转化拟南芥
• 2.2.4.3 拟南芥抗性株系筛选
• 2.2.4.4 DNA 小量提取和PCR 鉴定
• 2.2.5 转基因植株中外源基因变异小人胰岛素原（MF）Southern 杂交分析
• 2.2.5.1 转基因拟南芥基因组DNA 大量提取和纯化
• 2.2.5.2 基因组DNA 的限制性酶切和凝胶电泳分离
• 2.2.5.3 转膜印迹与固定
• 2.2.5.4 探针制备和标记
• 2.2.5.5 预杂交和杂交
• 2.2.5.6 封阻、抗体温育和洗膜
• 2.2.5.7 显影
• 2.2.6 转基因植株反转录PCR 分析
• 2.2.6.1 转基因拟南芥种子RNA 提取
• 2.2.6.2 转基因拟南芥叶片RNA 提取
• 2.2.6.3 两步法进行RNA 反转录PCR 检测
• 2.2.7 转基因拟南芥蛋白表达检测
• 2.2.7.1 拟南芥种子总蛋白提取
• 2.2.7.2 拟南芥种子总蛋白SDS-PAGE 检测
• 2.2.7.3 拟南芥种子总蛋白Western blot 检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 油体-小人胰岛素原融合基因（oleosin-mins）植物表达载体构建
• 3.1.1 小人胰岛素原基因（mins）的设计
• 3.1.2 双元表达载体op::og-mins-2300-twin 构建步骤
• 3.1.3 阳性克隆PCR 检测和测序
• 3.2 油体-变异小人胰岛素原融合基因（oleosin-MF）植物表达载体构建
• 3.2.1 人工引入突变获得变异小人胰岛素原基因（MF）
• 3.2.2 双元表达载体op::og-MF-2300-twin 构建步骤
• 3.2.3 阳性克隆PCR 检测和测序
• 3.3 工程农杆菌GV3101 的制备
• 3.4 拟南芥的种植和农杆菌介导的遗传转化
• 3.5 转基因拟南芥的PCR 检测
• 3.6 转基因拟南芥Southern 杂交分析
• 3.7 目的基因在拟南芥中的表达分析
• 3.8 转基因拟南芥目标蛋白表达检测
• 3.8.1 种子总蛋白SDS-PAGE 分析
• 3.8.2 种子总蛋白Western 杂交分析
• 第四章 讨论
• 4.1 拟南芥作为油体植物生物反应器的模式植物
• 4.2 载体和基因的设计
• 4.3 目标蛋白分离纯化的路线
• 4.4 目标蛋白表达量的提高
• 4.5 荠菜油体启动子在拟南芥中的组织特异性
• 4.6 使用油体表达系统生产重组人胰岛素的经济价值
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 后续研究工作
• 5.2.1 目的蛋白的分离纯化
• 5.2.2 植物油体表达的重组人胰岛素活性检测
• 5.2.3 融合蛋白在油菜中的表达
• 5.2.4 启动子组织特异性研究
• 参考文献
• 致谢