Survivin反义寡核苷酸治疗人涎腺腺样囊性癌的实验研究

论文摘要

目的:涎腺腺样囊性癌（Salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）,是一种常见的涎腺恶性肿瘤。其恶性程度高,侵袭性强,易复发、易早期转移。且对放疗、化疗不敏感,手术治疗难以根除。因此,寻求有效的辅助性治疗手段非常必要。survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of aoptosis proteins,IAP）家族的新成员,特异表达于人的胚胎组织以及多数人类肿瘤细胞。在成人,由于survivin主要特异地表达于肿瘤组织,使得反义survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。本实验利用人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系Acc-M探讨survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对survivin基因表达的影响,及其诱导肿瘤细胞凋亡的效果;同时建立Acc-M裸鼠移植瘤模型,探讨survivin反义寡核苷酸对该肿瘤细胞形态结构、细胞凋亡以及肿瘤生长速度的影响,为人涎腺腺样囊性癌的临床基因治疗提供实验依据。方法:1材料（1）人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系（Acc-M）。（2）针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。（3）15只SPF级雌性Balb/c裸小鼠,4-5周龄。2方法（1）细胞培养:Acc-M细胞培养于RPMI1640含胎牛血清和双抗的培养液中,5%CO2、37℃恒温孵育。（2）体外实验:设计合成针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染Acc-M细胞,通过RT-PCR,Western-blot检测survivin表达的改变,MTT测定细胞增殖抑制,流式细胞术测定细胞凋亡率。（3）动物实验:建立裸鼠皮下移植模型,待肿瘤直径达1.0cm,采用survivin反义寡核苷酸联合脂质体作用于裸鼠移植瘤局部,并设正义管核苷酸（sense oligonucleotide, SODN）对照组和空白对照（NS）组,每4天瘤内注射一次,共治疗13天,第14天麻醉后处死裸鼠,观察移植瘤体积和瘤重的变化,流式细胞术测定细胞凋亡率,HE染色观察移植瘤结构改变。结果:1.转染ASODN组survivin表达下降,其中mRNA表达下降达43.03%,显著低于SODN组、脂质体组和空白对照组（P<0.05）,蛋白表达下降36.03%,显著低于SODN组、脂质体组和空白对照组（P<0.05）。细胞凋亡率明显提高,流式结果显示ASODN组细胞凋亡率为25.9%。而SODN组为1.98%,脂质体组2.08%,空白对照组为1.93%。前者与后三组各组间均有显著差异（P<0.05）,而后三组之间无差别（P>0.05）。MTT试验显示转染ASODN组细胞增殖明显受抑制,且与浓度有一定依赖性,ASODN组IR均增高,800nmol/L和1000nmol/L组细胞抑制率分别达37.61%和46.42%,显著高于其余各组。而SODN组、脂质体组与空白组间无明显差异。2.裸鼠移植瘤治疗结束时,NS组、SODN组、ASODN组体积均数分别为（以cm3为单位）:3.09±0.06,2.92±0.13,1.309±0.27。ASODN组裸鼠肿瘤生长明显受到抑制,抑制率为57.6%。NS组、SODN组、ASODN组肿瘤质量均数分别为（以g为单位）:4.97±0.54,4.40±0.51,2.32±0.87,ASODN组抑瘤率为53.4%。肉眼观察:肿瘤椭圆形,结节状,有包膜,表面光滑,个别瘤体表面有破溃。剖面实性,灰白色,部分区域由黄白色豆渣样物,似坏死组织。光镜观察:肿瘤片状排列,细胞呈圆形或多边形,胞浆红染。胞核圆形,居中,核大而深染,核浆比例增大,异型性明显,核分裂像易见。ASODN组中可见成片的凋亡细胞,细胞体积缩小,胞浆固缩,可见凋亡小体。SODN、NS组肿瘤细胞成片生长,偶见凋亡细胞。流式细胞分析术检测显示ASODN组凋亡率达32.5%而SODN组、NS组凋亡率为6.22%和5.60%。结论:1 Survivin反义寡核苷酸能有效沉默涎腺腺样囊性癌中survivin的表达。2细胞培养和裸鼠移植瘤实验均证明Survivin反义寡核苷酸具有明显促进SACC细胞凋凋亡,抑制其增殖的作用。3 Survivin反义寡核苷酸联合脂质体可作为SACC基因治疗的新途径,具有良好的临床应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 survivin 反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 第二部分 survivin 反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的作用
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历