南林895杨无选择标记遗传转化的研究

论文摘要

本文以南林895杨为试验材料,通过农杆菌介导法,利用构建的可去除选择标记载体PX6-GFP和PX6-CpTI,开展杨树无选择标记遗传转化的研究,分析转化效率和选择标记基因去除效率,旨在为培育无选择标记基因的转基因杨树提供试验依据,主要进展如下:1.构建了可去除选择标记基因的植物表达载体PX6-CpTI。通过PCR扩增获得载体pFZY1上的抗虫基因CpTI,经测序验证和分析后,利用可去除选择标记载体系统PX6,构建植物表达载体PX6-CpTI。2.获得南林895杨转基因植株。通过农杆菌介导的优化的遗传转化体系,利用可去除标记载体PX6-GFP和PX6-CpTI,开展南林895杨遗传转化研究。经统计,共获得PX6-GFP Km抗性植株51株,其中26株PCR检测呈阳性;获得PX6-CpTI Km抗性植株11株,其中6株PCR检测呈阳性。3.诱导去除选择标记基因。选取PCR检测呈阳性的部分转基因植株,将其置于含有5μM诱导物β-雌二醇的生根培养基上,同时每隔3d向植株喷洒诱导液（1/2MS+β-雌二醇5μM）,持续30d。4.选择标记基因的去除效率分析。对诱导后的转基因植株采用PCR、DNA测序、GFP荧光检测等方法进行分析,证实了选择标记基因已在杨树转基因植株上被去除。在21棵转基因植株中,检测出已去除选择标记的转基因植株1棵,另有1棵为部分去除。5.转基因植株标记基因去除后对Km敏感性测定。通过对转基因植株诱导前后其叶盘对Km敏感性的对比试验,发现经诱导去除标记基因后,转基因植株叶盘对Km的敏感性与对照叶盘（未转基因植株）基本一致,表明可以使用Km筛选体系进行杨树转基因的多次转化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 上篇 文献综述
• 前言
• 第一章 转基因林木的生态安全性
• 1. 转基因林木应用的安全现状
• 2. 转基因林木对环境的可能影响
• 3. 防范转基因林木对环境可能影响的对策
• 第二章 选择标记基因引起的转基因安全性问题及对策
• 1. 选择标记基因的应用及原理
• 2. 常用的选择标记基因
• 3. 选择标记基因的安全性问题
• 3.1 选择标记可能影响基因的表达
• 3.2 选择标记可能影响环境安全
• 3.3 选择标记可能危及人身安全
• 3.4 选择标记可限制多个基因的转化
• 3.5 选择标记可能影响植物的某些性状
• 4. 解决选择标记基因安全性问题的策略
• 4.1 避免使用选择标记基因
• 4.2 使用无争议的生物安全标记基因
• 4.2.1 与糖代谢途径相关的基因
• 4.2.2 甜菜醛脱氢酶基因
• 4.2.3 与激素代谢途径相关的基因
• 4.2.4 谷氨酸-1-半醛转氨酶基因
• 4.3 利用报告基因
• 4.3.1 GUS 基因
• 4.3.2 绿色荧光蛋白（GFP）基因
• 4.4 选择标记基因的去除
• 第三章 去除选择标记基因的策略
• 1. 共转化法
• 2. 位点特异性重组
• 2.1 Cre/lox 系统
• 2.2 FLP/FRT 系统
• 2.3 R/RS 系统
• 2.4 化学诱导表达的位点特异性重组系统
• 3. 转座子系统
• 4. 利用同源重组作用
• 5. 利用其他方法
• 6. 本研究的目的和意义
• 下篇 研究报告
• 第一章 可去除选择标记植物表达载体的构建
• 1. 材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 仪器和设备
• 1.5 培养基
• 2. 方法
• 2.1 质粒DNA 的提取
• 2.1.1 碱法小量提取质粒DNA
• 2.1.2 试剂盒提取质粒DNA
• 2.2 DNA片段回收
• 2.3 大肠杆菌感受态的制备
• 2.4 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选
• 2.5 农杆菌感受态的制备
• 2.6 液氮冻融法转化农杆菌
• 2.7 保存菌株
• 3. 可去除选择标记表达载体构建路线
• 3.1 含CpTI 基因的DNA 片段的扩增
• 3.1.1 引物设计
• 3.1.2 PCR 扩增
• 3.1.3 回收片段与T 载体连接
• 3.1.4 转化子的鉴定与测序
• 3.2 CpTI 基因的获得
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 PCR 扩增
• 3.2.3 CpTI 基因与T 载体连接
• 3.2.4 转化子鉴定
• 3.3 酶切与连接
• 3.3.1 酶切
• 3.3.2 连接
• 3.3.3 PCR 检测
• 3.4 农杆菌转化与保菌
• 4. 结果与分析
• 4.1 测序结果分析
• 4.2 PCR 扩增CpTI 基因
• 4.3 PX6-GFP 和PMD19-CpTI 酶切结果
• 4.4 讨论
• 第二章 南林895 杨遗传转化
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 抗生素与激素
• 1.4 植物培养基
• 2. 方法
• 2.1 农杆菌介导的遗传转化（叶盘法）
• 2.1.1 预培养
• 2.1.2 正负对照的设置
• 2.1.3 外植体的侵染
• 2.1.4 共培养
• 2.1.5 筛选培养
• 2.1.6 芽伸长培养
• 2.1.7 生根培养
• 2.1.8 继代培养
• 2.2 Km 抗性植株的分子检测
• 2.2.1 CTAB 法提取植物总DNA
• 2.2.2 Km 抗性植株的PCR 检测
• 2.3 转基因植株的移栽
• 3. 结果与分析
• 3.1 Km抗性植株的获得
• 3.2 Km抗性植株的分子检测结果
• 4. 讨论
• 4.1 转化过程中一些问题的探讨
• 4.2 假转化体的产生
• 4.3 转化过程中T-DNA 片段整合的不完整性
• 第三章 选择标记基因的去除
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 培养基
• 2. 方法
• 2.1 载体PX6-GFP 去除选择标记的原理
• 2.2 转基因植株标记基因去除的诱导
• 2.3 转基因植株标记基因去除的检测
• 2.3.1 PCR 检测
• 2.3.2 测序检测
• 2.3.3 GFP 检测
• 2.4 去除标记基因后叶盘的Km 敏感性测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 PCR 检测结果
• 3.2 测序检测结果
• 3.3 GFP 检测结果
• 3.4 去除标记基因后叶盘的Km 敏感性测定结果
• 4. 讨论
• 4.1 可去除选择标记载体系统PX6 的优点
• 4.2 PX6 载体系统去除标记基因效率
• 4.3 利用标记基因的去除进行多次转化
• 第四章 主要结论和进一步的研究展望
• 1. 主要结论
• 2. 进一步研究展望
• 附录
• 参考文献
• 详细摘要