CYP2C9基因多态性对双氯芬酸代谢以及药物抑制性相互作用的影响

论文摘要

细胞色素P450 2C9 （CYP2C9）是一种多态性酶,负责代谢许多临床药物,包括非甾体抗炎药、抗抑郁药、降糖药、心血管药物和口服抗凝剂。CYP2C9酶活性在不同人群中存在个体差异,主要是因为CYP2C9基因存在非同义单核苷酸多态性（SNPs）。CYP2C9*3和CYP2C9*13是存在于中国人群中最主要的两个突变等位基因,其分布频率分别为3.3%和1.02%。有文献报道,CYP2C9*3突变造成双氯芬酸代谢活性的降低,并且能够改变双氯芬酸与其他药物间发生药物药物相互作用（DDIs）的程度,从而引起带有该突变等位基因的个体发生潜在的药物不良反应（ADRs）。但是关于CYP2C9*13对双氯芬酸代谢的影响还没有很好的研究,并且对于该突变是否影响双氯芬酸和其他临床药物的相互作用未见报道。与CYP2C9*3在体内的大量研究不同,由于CYP2C9*13分布频率相对较低,携带有CYP2C9*13基因型的个体很难收集,这就使得对该突变的临床研究很受限制,因此,通过体外代谢数据预测CYP2C9*13引起的体内药代动力学变化是一项非常重要的研究工作。根据文献报道,关于CYP2C9基因多态性对各种药物代谢动力学影响的预测方法已成功建立,但是关于CYP2C9*13对不同药物的体外代谢数据报道较少,因此对于该突变的体内预测也未见报道。CYP2C9基因多态性能够显著影响CYP2C9介导的药物相互作用的程度。体外研究表明,CYP2C9*3能够改变许多临床药物对CYP2C9酶参与代谢其他药物的抑制潜能。体内研究表明,CYP2C9*3影响氟比洛芬和氟康唑的相互作用程度。到目前为止,关于CYP2C9*13对双氯芬酸与其他药物相互作用的影响未见报道。了解CYP2C9基因突变对药物间相互作用的影响,能够帮助携带有不同CYP2C9基因型的个体,在联合使用双氯芬酸和其他药物时,避免ADRs的发生。本研究通过CYP2C9.1（野生型）、CYP2C9.3和CYP2C9.13在酵母细胞中的表达,确定了这三个重组酶代谢双氯芬酸生成4’-羟基双氯芬酸的动力学参数。根据这些体外数据,我们预测了带有CYP2C9*3或CYP2C9*13基因型的个体对双氯芬酸口服清除率的比值（与野生型比值,CLoralR）。结果表明这些突变都不同程度地降低了双氯芬酸口服清除率。此外,我们探索了CYP2C9*3和CYP2C9*13对双氯芬酸与九种临床药物相互作用的影响,并将这些影响与野生型比较,结果表明,CYP2C9*3和CYP2C9*13能够不同程度地改变大部分药物（抑制剂）对CYP2C9酶代谢双氯芬酸的抑制程度,尤其是CYP2C9*13能够明显降低磺胺苯吡唑、氟伐他汀、氟伏沙明和反苯环丙胺的抑制能力。本研究结果为携带有CYP2C9*3和CYP2C9*13等位基因的个体在联合服用双氯芬酸与其他药物时,提供了可靠的理论指导。在基因分型的研究中,我们考察了74名中国人CYP2C9*3等位基因分布情况。采用聚合酶链式反应（PCR）—限制性片段长度多态性（RFLP）分析法检测74名中国人CYP2C9*3基因型,并且对PCR产物直接测序验证酶切结果的准确性。结果显示,有3例CYP2C9*3突变型杂合体,其余71例均为野生型纯合体,未检出CYP2C9*3突变型纯合体。测序结果证实该方法高效、特异、准确,可用于CYP2C9*3基因型分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 细胞色素P450及其在药物代谢研究中的作用
• 1.1.1 CYP450命名与分布
• 1.1.2 CYP450结构特征及催化机制
• 1.1.3 CYP450的多样性
• 1.2 CYP2C9基因多态性及其对药物代谢影响
• 1.2.1 CYP2C9基因结构及上游调控区域
• 1.2.2 CYP2C9基因多态性及其突变频率分布
• 1.2.3 CYP2C9基因多态性与药物代谢的关系
• 1.2.4 CYP2C9与药物相互作用
• 1.2.5 CYP2C9基因多态性与个体化用药
• 1.2.6 CYP2C9基因多态性分析
• 1.3 药物代谢研究方法
• 1.4 论文研究目的与意义
• 第二章 CYP2C9*13基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基及常用溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 CYP2C9*13引物设计
• 2.2.2 CYP2C9*13 cDNA的获得
• 2.2.3 CYP2C9*13突变载体的构建
• 2.2.4 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备和转化
• 2.2.5 重组质粒的鉴定
• 2.2.6 重组质粒在酵母系统中的表达及鉴定
• 2.2.7 酵母微粒体的制备和检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 CYP2C9*13 cDNA的扩增
• 2.3.2 CYP2C9*13重组质粒的鉴定
• 2.3.3 Western-Blotting分析目的蛋白表达
• 2.3.4 微粒体蛋白浓度测定
• 2.3.5 CYP2C9酶的CO定量
• 2.4 讨论
• 第三章 CYP2C9基因多态性的体外酶促反应动力学分析和药物抑制试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 酵母微粒体
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 CYP2C9野生型和突变体代谢双氯芬酸酶促反应动力学分析
• 3.2.2 预测CYP2C9*3和CYP2C9*13代谢双氯芬酸的口服清除率
• 3.2.3 药物抑制试验
• 3.2.4 统计学分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 酶促反应条件的确定
• 3.3.2 Diclofenac 4’-hydroxylation标准曲线的建立及回收率测定
• 3.3.3 CYP2C9.1、CYP2C9.3和CYP2C9.13酶促反应动力学分析
• 3.3.4 预测CYP2C9基因多态性对双氯芬酸口服清除率的影响
• 3.3.5 CYP2C9基因多态性对药物药物相互作用的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 CYP2C9.1、CYP2C9.3和CYP2C9.13酶促反应动力学分析
• 3.4.2 预测CYP2C9基因多态性对双氯芬酸口服清除率的影响
• 3.4.3 CYP2C9基因多态性对药物药物相互作用的影响
• 第四章 PCR-RFLP法进行CYP2C9*3基因分型
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验对象
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 DNA的提取
• 4.2.2 CYP2C9基因扩增的引物设计
• 4.2.3 CYP2C9基因扩增
• 4.2.4 PCR扩增产物分析
• 4.2.5 测序验证基因分型结果的可靠性
• 4.3 结果
• 4.3.1 74名中国人CYP2C9*3基因型分析
• 4.3.2 测序结果
• 4.3.3 74名中国人CYP2C9*3等位基因频率
• 4.4 讨论
• 4.4.1 CYP2C9*3等位基因频率
• 4.4.2 PCR反应条件的优化
• 4.4.3 酶切反应条件的优化
• 4.4.4 阴性和阳性对照实验
• 4.4.5 基因突变检测方法的比较
• 全文小结
• 参考文献
• 硕士学位期间主要成果
• 致谢